聶　睿，于　洋，倪永清（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆乳品中乳酸菌的多樣性及耐藥性分析

聶睿，于洋，倪永清*
（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

從新疆北部地區(qū)采集的樣品中分離出103株乳酸菌并進(jìn)行生理生化表型鑒定，對這些乳酸菌進(jìn)行16S rRNA基因序列測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)分離的乳酸菌主要為5個(gè)屬分別為乳桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、魏斯式菌屬、明串珠菌屬。采用紙片擴(kuò)散法（K-B）研究不同屬中不同乳酸菌對8種常見抗生素的耐藥性分析。耐藥性研究表明，分別有6株對鏈霉素、新霉素有耐藥性，5株對紅霉素有耐藥性，7株對卡那霉素有耐藥性，8株全部對萘啶酸具有耐藥性，4株對萬古霉素、四環(huán)素具有耐藥性，2株對頭孢唑肟存在耐藥性。

新疆；乳酸菌；多樣性；耐藥性

乳酸菌是一類發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱［1］，在20世紀(jì)初，術(shù)語“乳酸細(xì)菌”是用來指“乳中發(fā)酵產(chǎn)酸的生物”［2］。到目前乳酸菌主要分為乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、肉桿菌屬、明串珠菌屬等，約為36個(gè)屬［3］，被廣泛應(yīng)用在乳品、果蔬、發(fā)酵肉品加工過程中。乳酸菌除了對這些產(chǎn)品的香氣成分有所作用，其代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸、過氧化物、雙乙酰、細(xì)菌素等）還能夠抑制食源性的微生物對食品的污染［4］。特別是在發(fā)酵乳品中，乳酸菌作為起始發(fā)酵劑可以起到增香的作用。

隨著工業(yè)發(fā)展，乳酸菌在能夠促進(jìn)食品的生物轉(zhuǎn)化，改善產(chǎn)品感官特性以及提高發(fā)酵食品的質(zhì)量和安全性能的同時(shí)還能夠促進(jìn)食品中營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生［5］。近20年由于人類在醫(yī)藥動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素的現(xiàn)象較為嚴(yán)重，如果將攜帶可轉(zhuǎn)移耐藥因子的乳酸菌菌株應(yīng)用在生產(chǎn)中，將會(huì)嚴(yán)重威脅到食品的安全性，因此乳酸菌的耐藥性是目前國際上對其安全性評價(jià)的一個(gè)重要組成部分得到了國際普遍的關(guān)注，特別是由多重耐藥性發(fā)展至對臨床常用抗生素的普遍耐藥性［6-8］。在2013年歐洲食品安全署（局）（european food safety authority，EFSA）頒布的安全資格認(rèn)證（qualified presumption of safety，QPS）方案就明確要求獲得安全認(rèn)證的乳酸菌菌株應(yīng)不存在獲得性毒力基因［9］，2014年，世界衛(wèi)生組織就人類及其食品消費(fèi)鏈中抗生素抗性監(jiān)管的缺失及一體化監(jiān)管也做了重點(diǎn)關(guān)注［10］。

新疆地域廣闊、草場肥沃、牛羊成群，是一個(gè)多民族聚集的地方，奶疙瘩、酸奶子、奶豆腐、奶皮子、酥油等乳品成為當(dāng)?shù)仫嬍持斜夭豢缮俚慕M成部分。豐富的發(fā)酵乳品中孕育著天然乳酸菌的寶庫，為研究新疆乳酸菌多樣性提供了豐富的條件，也為發(fā)酵工業(yè)提供許多可開發(fā)和利用的資源。本研究對新疆不同地域來源的乳制品進(jìn)行乳酸菌的篩選和鑒定，對所分離的菌株進(jìn)行藥敏性試驗(yàn)，為抗生素的合理使用和乳酸菌安全性評價(jià)提供參考。

1　材料和方法

1.1料

1.1.1品

固體奶疙瘩樣品主要來源于自新疆北部地區(qū)的伊犁（YL）、塔城（TC）；液體酸馬奶、酸牛奶樣品來自博樂（BL）、阿勒泰（AT）地區(qū)。樣品均為隨機(jī)采取牧民自制乳制品。

1.1.2劑

30%H2O2溶液：天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠；Tris-飽和酚：北生物商貿(mào)有限公司；乙醇：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑廠；瓊脂糖：美國BBI公司；藥敏紙片用濾紙片制成直徑為7mm的圓形紙片，放入小西林瓶中121℃滅菌2 h。然后在無菌的條件下將抗菌原液加入裝有紙片的小西林瓶，37℃、24 h烘干，劑量參照參考文獻(xiàn)［11］。

1.1.3養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20g，吐溫-80 1m L，MgSO4·7H2O 0.588 g，MnSO4·H2O 0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000m L，pH 6.2～6.4。

MH肉湯培養(yǎng)基：牛肉粉2.0 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酸水解酪蛋白17.5 g/L，pH值7.4±0.2。

Elliker瓊脂培養(yǎng)基、M 17培養(yǎng)基、膽汁七葉靈苷疊氮鈉培養(yǎng)基和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2器與設(shè)備

ZWY-2102雙層恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；141-122閉式0～150mm不銹鋼游標(biāo)卡尺：桂林廣陸量具廠；0.22μm微孔濾膜：上海興亞凈化材料廠；5810R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf儀器公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱：寧波市江南儀器廠；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；LAC-5040S全自動(dòng)高壓滅菌鍋：韓國LabTech公司；BCD-265F冷藏冷凍箱：榮事達(dá)集團(tuán)；WhitelyDG250厭氧箱：英國DonWhitely科學(xué)有限公司。

1.3法

1.3.1株的分離和純化

固體樣品：分別取所有奶疙瘩樣品10g，搗碎，用90m L無菌水稀釋于錐形瓶中充分?jǐn)嚢杈鶆颍浞秩芙夂笥谡袷幤魃险駬u20min，使樣品與水充分混合。

液體樣品：1m L樣品放入裝有100m L無菌水三角瓶中，37℃搖床振蕩40min得菌懸液。

吸取菌懸液，采用梯度稀釋法分別涂布于5種不同的培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做3次平行。后將平板放置在37℃厭氧培養(yǎng)36 h，然后挑取單菌落純化2次。

1.3.2株初篩

觀察菌落形態(tài)顏色大小并對純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，過氧化氫試驗(yàn)，初步確定為疑似乳酸菌，將純化好的菌株保存于20%甘油中，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。根?jù)參考文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行生理生化試驗(yàn)部分。

1.3.3株鑒定

利用CTAB法提取乳酸菌DNA，采用通用引物27f/1492r進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增。將測定的16S rRNA序列與GENBANK數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行BLAST同源性比對分析，運(yùn)用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.4敏實(shí)驗(yàn)

效價(jià)的測定：采用肉湯稀釋法，使用無菌試管用MH培養(yǎng)液對待測抗菌進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋。再加入等量的待測菌液37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察哪一個(gè)稀釋度能一直細(xì)菌生長，即為測定終點(diǎn)，再與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)抗生素的終點(diǎn)比較，得出所用抗生素的效價(jià)。效價(jià)（U/mg）是指抗生素的效價(jià)單位與質(zhì)量（一般是mg）的折算比例。U指具有一定生物效能的最小效價(jià)單位。

紙片擴(kuò)散法（K-B）測藥敏性：用MRS液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接兩次，得到活化菌株。將15m LMRS瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。待凝固后，再倒入15m L含有10%新鮮菌液（菌液濃度為1×10-7CFU/m L）的軟瓊脂（0.8%的瓊脂）。待上層培養(yǎng)基凝固冷卻后，在無菌條件下將藥片輕輕貼在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。為了提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1離的乳酸菌表型鑒定結(jié)果

分離的乳酸菌經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢。從樣品中共分離103株疑似乳酸菌。其中桿菌約占70%，球菌約占30%。菌株均為G+，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。大部分菌落直徑約1mm、乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1　乳品中乳酸菌菌株的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of lactic acid bacteria from dairy products

續(xù)表

在果糖實(shí)驗(yàn)中，只有BL4-2、BL5-4、TC2-5、TC1-2、AT1-6、TC2-4、YL5-2這7株菌為陰性，其他均為陽性。而TC2-4、TC1-2在葡萄糖與葡萄糖酸鹽實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果均為陰性，有一半株菌在半乳糖實(shí)驗(yàn)中顯陽性，菌株YL5-2只在半乳糖實(shí)驗(yàn)中顯陽性，其他各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均為陰性。大部分的菌株不能分解精氨酸，只有8株菌能夠分解精氨酸產(chǎn)生NH3。在棉籽糖實(shí)驗(yàn)中，有6株菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，其他均菌株為陰性。

2.2于部分16S rRNA基因序列乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

將從乳品中分離篩選出的乳酸菌菌株的部分16S rRNA基因序列提交NCBI，通過BLAST工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對，并選取同源性最高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知24株從乳中分離隸屬于Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Weissella這五個(gè)屬。雷霞［13］從內(nèi)蒙古伊敏河牧區(qū)和海拉爾牧區(qū)地區(qū)主要為Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。孫天松等［14］對采集自新疆和蒙古國的4份傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離鑒定，得到了10株乳桿菌和3株乳球菌有所不同。根據(jù)發(fā)育樹菌株YL5-1、TC4-5、YL1-1、YL3-1與Enterococcus faecalis、Enterococcus durans和Enterococcus faeclum構(gòu)成一個(gè)分支，且16S rRNA基因序列相度非常高，均為100%，可確定隸屬于該屬。Lactobacillus屬包括的五株菌TC3-1、YL2-1、BL4-4、TC3-5和AT1-4分別與已知Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei構(gòu)成一個(gè)分支且同源性序列相似度高，AT1-4與Lactobacillus casei構(gòu)成另一個(gè)分支。菌株BL3-6、AT3-4分別與Lactococcus raffinolactis、Lactococcus piscium構(gòu)成一個(gè)分支，菌株BL1-2、TC3-5與Lactococcusgarvieae構(gòu)成一個(gè)分支。而菌株YL2-2、YL3-4與Lactococcus lactis，Lactococcus lactis subsp.lactis兩個(gè)不同的種形成一個(gè)分支，這樣只能確定隸屬于Lactococcus屬。Leuconostoc屬包括TC1-2、TC2-4、BL3-2、AT1-6四株，且比對同源性在98%以上。Weissella屬中的兩株菌AT2-6、YL-5-2也與Weissella koreeniss、Weissella cibaria構(gòu)成了兩個(gè)分支，同源性＞99%。但是以上利用16S rRNA基因序列比對構(gòu)建的發(fā)育樹只能是對乳酸菌的初步屬水平的鑒定，鑒定的結(jié)果還需要利用種間特異性PCR才能將乳酸菌鑒定到種。

圖1　基于部分16SrRNA基因序列的乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on partial 16S rRNA sequences

2.3乳酸菌的耐藥結(jié)果與分析

按照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)化紙片藥敏測定法，常分為以下3個(gè)等級：耐藥（Resistant，R）、敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）。

表2　乳酸菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Antimicrobialsusceptibility results of lactic acid bacteria

本實(shí)驗(yàn)選用常見的8種抗生素對新疆乳品8種代表菌株進(jìn)行耐藥實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌株都存在耐藥性，菌株不只對一種抗生素具有耐性，而是具有多重耐藥性。6株對鏈霉素、新霉素耐藥；5株對紅霉素耐藥；7株對卡那霉素耐藥；8種菌株全部對萘啶酸耐藥；4株對萬古霉素、四環(huán)素耐藥；2株對頭孢唑肟耐藥。宋曉敏等［15］在對發(fā)酵食品中乳酸菌耐藥性現(xiàn)狀分析中腸球菌屬對萬古霉素、紅霉素具有耐藥性。PAN L等［16］對11種中國發(fā)酵食品中分離的17株乳酸菌進(jìn)行對氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、克林霉素和紅霉素的抗性測定，發(fā)現(xiàn)耐藥乳酸菌普遍存在于中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，其抗性發(fā)生率與原材料和生產(chǎn)區(qū)域有關(guān)。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從新疆部分地區(qū)分離出103株乳酸菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rRNA基因序列選取同源性最高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得24株乳酸菌分別隸屬于6個(gè)屬。隨后利用8種不同的抗生素對8種代表菌株進(jìn)行耐藥實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別有6株對鏈霉素和新霉素有耐藥性，4株菌對四環(huán)素和萬古霉素有耐藥性，7株對卡那霉素有耐藥性，5株對紅霉素具有耐性，所有用于藥敏實(shí)驗(yàn)的菌株對萘啶酸都有耐藥性，2株對頭孢唑肟具有耐藥性。不同來源的乳制品中分離到的優(yōu)勢菌群和菌種的多樣性是不相同，主要有可能是地理，氣候等自然環(huán)境的影響，以及少數(shù)民族牧民在制作乳品時(shí)采用的發(fā)酵溫度、時(shí)間及方法，牧民的生活習(xí)慣以及擠奶使用的用具容器也存在差異，這就造成各個(gè)地區(qū)不同自然發(fā)酵乳制品中分離的乳酸菌種類存在著一定差異。通過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離的菌株是存在不同水品的耐藥性，可能會(huì)通過食物鏈傳遞到人的腸道致病菌埋下了巨大隱患，所以在今后對于乳酸菌的耐藥性問題特別的關(guān)注。

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Diversity of lactic acid bacteria and analysis of their antibiotic resistance from the dairy products in Xinjiang

NIERui，YU Yang，NIYongqing*
（College ofFood Science，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China）

103 strainsof lactic acidbacteriawere isolatedand identifiedby physiologicaland biochem icaltest from samplein thenorthern area Xinjiang，and then the strainswere identified by 16S rRNA sequencing and phylogenetic treewas constructed.Results showed that the isolated lactic acid bacteriamainly comprised fivegenera:Lactobacillus，Enterococcus，Lactococcus，Weissella，and Leuconostoc.Thedrug resistance testof lactic acid bacteria to eightkindsof common drugswere conducted by K-Bmethod.The results showed thatsix strainswere resistant to streptomycin，and six strains were resistantto neomycin，only fivestrainswere resistant to erythrocin，sevenstrainswere resistantto kanamycin.A llof eight strainswere resistant to nalidixic acid，fourstrainswere resistant to vancomycin，four strainswere resistant to tetracycline，and only two strainswere resistant to epocelin.

Xinjiang；lactic acid bacteria；diversity；antibiotic resistance

TS201．3

0254-5071（2016）01-0047-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．011

2015-10-26

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)（2011BB009）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金專項(xiàng)（2011CB001）；石河子大學(xué)自然科學(xué)科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（ZRKX20104001）

聶睿（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛夹g(shù)。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锖头肿由锛夹g(shù)。