李夢雅，鄧毛程，李　靜，王　瑤，陳維新，梁增章（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

生香酵母篩選鑒定及其對辣椒醬發(fā)酵的影響

李夢雅，鄧毛程*，李靜，王瑤，陳維新，梁增章
（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

為了獲得適用于辣椒醬發(fā)酵的生香酵母，從自然發(fā)酵辣椒醬中篩選優(yōu)良菌種，并對菌種形態(tài)特征、生理生化特性、菌種發(fā)酵辣椒基料等進行了研究。經(jīng)篩選，獲得一株生香能力較強的菌株LA-Y09，該菌株被鑒定為魯氏酵母（Saccharomycesrouxii）。菌種LA-Y 09的最適生長溫度為28℃，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的培養(yǎng)基中仍有較高菌數(shù)，說明其具有良好的耐鹽特性，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的辣椒基料中能夠生成多種呈現(xiàn)蜜香和果香的香氣成分，使辣椒發(fā)酵醪香氣得到明顯提升。

生香酵母；辣椒醬；篩選；耐鹽

辣椒果實味辛香、性溫?zé)?，含有豐富的辣椒堿、辣椒色素、維生素、有機酸和礦物質(zhì)等成分，是兼有營養(yǎng)價值和調(diào)味作用的蔬菜［1］。我國辣椒的種植面積僅次于白菜類蔬菜，已成為我國第二大蔬菜作物，現(xiàn)有年產(chǎn)量達2 800萬t，約占全球產(chǎn)量的46%左右［2］。隨著世界各地及各應(yīng)用領(lǐng)域的需求量增大，辣椒除了直接被鮮食以外，還被加工成辣椒干、辣椒粉、辣椒油、辣椒醬、辣椒堿和辣椒色素等產(chǎn)品［3］。其中，辣椒醬是人們最常見的一種佐餐調(diào)味品，產(chǎn)品種類繁多，風(fēng)味多樣，大致分為兩類：一類是利用辣椒及其制品為基料，配以蔬菜及其制品或動物肉品、水產(chǎn)品、植物油、香辛料及其他調(diào)味輔料而制成［4］；另一類是利用微生物對辣椒或其醬料進行發(fā)酵而制成，或再添加其他輔料調(diào)制而成。

發(fā)酵型辣椒醬制作技術(shù)源于傳統(tǒng)的蔬菜腌制，經(jīng)微生物（主要是乳酸菌）自然發(fā)酵后，產(chǎn)品酸辣可口，風(fēng)味獨特，深受消費者青睞。但是，傳統(tǒng)的發(fā)酵辣椒醬的生產(chǎn)周期長，參與自然發(fā)酵的微生物復(fù)雜，亞硝酸鹽和黃曲霉毒素等有害物質(zhì)的積累不易控制［5-6］，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定。為了提高發(fā)酵型辣椒醬的生產(chǎn)效率和有效控制有害物質(zhì)的積累，人工利用乳酸菌純種的強化發(fā)酵技術(shù)已得到較深入研究及工業(yè)化應(yīng)用［7］。與自然發(fā)酵的辣椒醬相比，單一乳酸菌強化發(fā)酵所得的辣椒醬在香氣方面卻相對遜色。以生香微生物與乳酸菌組合，對辣椒醬進行混合菌強化發(fā)酵，是提高產(chǎn)品香氣風(fēng)味的有效方法，但這方面的研究報道尚少。本研究通過篩選獲得生香酵母，并將其應(yīng)用于辣椒醬發(fā)酵試驗，期望能夠為開展混合菌強化發(fā)酵辣椒醬研究提供優(yōu)良菌種，為發(fā)酵型辣椒醬生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1料

自然發(fā)酵的辣椒醬：廣東茂德公食品集團有限公司；鮮紅辣椒：市售；母膏、蛋白胨、麥芽汁等生化試劑：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蔗糖、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基［8］：蔗糖50g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 100 g/L，氯霉素0.4 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.5。

平板培養(yǎng)基［8］：蔗糖20g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl10 g/L，氯霉素0.4 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)節(jié)pH 5.5。將平板培養(yǎng)基去除NaCl和氯霉素，作為斜面培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 5.5。

篩選培養(yǎng)基的成分同種子培養(yǎng)基，但蔗糖質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至50 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：200 g新鮮辣椒，經(jīng)清洗、打漿，加入8 g蔗糖、1 g酪蛋白胨和2 g麥芽汁浸膏，自然pH，混勻后裝入1 000m L三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后備用。

1.2器與設(shè)備

250B型生化培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；BSD150型振蕩培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；S-3000N型掃描電鏡：日本日立公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；A 200型基因擴增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀：北京榮陽經(jīng)典科技有限公司；Agilent7890GC/5977AMS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3法

1.3.1種分離

選擇香氣濃郁的自然發(fā)酵辣椒醬，稱取5 g，接入裝有200m L富集培養(yǎng)基的三角瓶，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，再吸取5m L培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中，置于同樣條件下培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液進行稀釋，涂布于平板培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)，挑取表面濕潤、光滑的單個菌落，接入斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)后保藏于4℃冰箱，備用。

1.3.2香微生物的篩選

將平板分離所得的各菌株，分別接入種子培養(yǎng)基，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20h。然后，取5m L種子液接入100m L的篩選培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件同種子培養(yǎng)。最后，通過嗅覺對培養(yǎng)液進行感官評定，辣椒醬品質(zhì)的優(yōu)劣很大程度取決于氣味，嗅覺測定是通過評鑒員嗅覺器官來測評，評價時香氣主要分為正常氣味和不正常氣味，并選取大多數(shù)評鑒員偏好的培養(yǎng)液樣品，進一步測定其總酯。測定總酯時，取100m L發(fā)酵液，加入等體積的純凈水，利用玻璃蒸餾裝置蒸出100m L餾出液，采用回流皂化法測定餾出液的總酯［9］，含量以乙酸乙酯計。根據(jù)感官評定和總酯測定的結(jié)果，優(yōu)選生香菌種。

1.3.3酯含量的計算

餾出液中總酯含量（以乙酸乙酯計）的計算公式如下：

式中：25為加入氫氧化鈉溶液的體積，mL；C1為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；C2為滴定用鹽酸溶液的濃度，mol/L；V2為滴定用鹽酸溶液的消耗體積，mL；0.088 12為乙酸乙酯的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。

1.3.4種鑒定

利用顯微鏡觀察優(yōu)選菌種的形態(tài)，并利用掃描電鏡對菌體形態(tài)進行觀察。參照文獻的生理生化試驗方法［10］，對優(yōu)選菌種進行生理生化特征分析。利用18S rDNA鑒定方法進行分子生物學(xué)鑒定，PCR擴增的引物為通用引物［11］：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，PCR反應(yīng)體系為20μL，包括：5× PCR緩沖液4μL，dNTP混合物1.6μL，引物1和引物2各1.0μL，Taq DNA聚合酶0.4μL（1.25U/μL），模板DNA 1μL，ddH2O補足至20μL。PCR反應(yīng)條件為98℃、3min；98℃、10 s；55℃、15 s；72℃、90 s；31個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送至北京華諾時代科技有限公司測序，在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中對拼接序列進行同源性檢索，并利用軟件MEGA 5.1構(gòu)建優(yōu)選菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5同溫度下的生長試驗

準(zhǔn)備若干瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，各接入10m L種子液，分別置于26℃、28℃、30℃、32℃和200 r/min條件下進行振蕩培養(yǎng)36 h。在培養(yǎng)過程中，每隔6 h取樣，進行梯度稀釋，涂布于平板培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)48 h，然后進行菌落計數(shù)，每克發(fā)酵醪所含菌數(shù)的表示單位為CFU/g。根據(jù)菌體生長情況，優(yōu)選菌種的最佳生長溫度。

1.3.6同鹽度條件下的生長試驗

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、8%、12%和16%的氯化鈉，并以無氯化鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，按上述方法接入種子液，置于最佳的生長溫度下進行振蕩培養(yǎng)24 h。然后，按上述的稀釋涂布法測定發(fā)酵醪的酵母菌數(shù)。根據(jù)菌體生長情況，分析菌種的耐鹽性。

1.3.7酵辣椒醬的揮發(fā)性成分分析

在優(yōu)選鹽度和溫度下，按上述方法，利用優(yōu)選菌種對辣椒基料進行發(fā)酵3 d，然后利用氣相色譜-質(zhì)譜儀對發(fā)酵醪的揮發(fā)性成分進行測定。測定時，采用固相微萃取法收集樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)，即稱取6g樣品密封于20m L頂空瓶中，放入三合一自動進樣器的樣品盤中，將帶有美國Supelco公司65μm PDMS/DVB SPME萃取頭的固相微萃取針穿過密封塞，插入頂空瓶中，于50℃條件下萃取40min，取出固相微萃取針迅速插入氣相色譜進樣口中，在250℃條件下解吸5m in，進行氣相色譜-質(zhì)譜（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）測定［12］。

參照文獻選擇氣相色譜條件和質(zhì)譜條件［13］。氣相色譜條件：AB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）彈性石英毛細管柱；載氣為He，流速為0.8m L/min；程序升溫，以8℃/min的升溫速度從50℃升至270℃，保持5.5min；進樣口溫度為250℃，進樣量為1.0μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1 500 V，質(zhì)量掃描范圍29～550 amu。

2　結(jié)果與分析

2.1種篩選

從分離平板上挑取了38個單菌落，通過搖瓶發(fā)酵和嗅覺評定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液香氣較強的菌株有5株，分別為LA-Y04、LA-Y09、LA-Y16、LA-Y18、LA-Y21。對發(fā)酵液測定總酯，結(jié)果如表1所示。在5株生香菌中，菌株LA-Y09產(chǎn)酯最大，其發(fā)酵液具有濃郁的果香和蜜香，適宜用于辣椒醬發(fā)酵，故被確定為進一步研究的菌種。

表1　5株菌的香氣評價和產(chǎn)酯情況Table 1 Flavorassessment and totalester yield of five strains

2.2株特征及鑒定

2.2.1株形態(tài)特征

在分離平板上，菌株LA-Y09的菌落表面濕潤、光滑、白色，呈邊緣整齊的圓形。在掃描電鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌體形態(tài)呈橢圓形，短軸直徑約為2.5～3.5μm，有子囊孢子的形成。

圖1　菌種LA-Y09的掃描電鏡圖（×4 000）Fig．1 SEM photographs of cellm orphology of strain LA-Y09（×4 000）

2.2.2株生理生化特征

菌種LA-Y 09的主要生理生化特征如表2所示，由表2可知，菌種可發(fā)酵D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，可同化D-山梨醇同化、D-甘露醇和乙胺同化，不能發(fā)酵D-半乳糖、乳糖、海藻糖、蜜二糖、纖維二糖、棉子糖和松三糖等，不能以硝酸鹽、亞硝酸鹽和尿素為唯一碳源。

表2　菌種LA-Y09的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiologicaland biochem ical identification results of strain LA-Y09

2.2.3株分子鑒定

菌株的PCR擴增電泳圖結(jié)果見圖2。利用軟件MEGA5.1以Neighbor-joining法對菌種LA-Y09構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖2菌種LA-Y09的18S rDNA PCR擴增電泳圖Fig．2 The 18S rDNA PCR am plification electrophoretogram of strain LA-Y09

圖3 菌種LA-Y09的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．3 The sequence phy logenetic tree of strain LA-Y09

由圖2可知，菌株LA-Y 09的18S rDNA序列長度為1 706 bp，在NCBI中進行同源性比對，與魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）IFO 0494（登錄號：AY227007.1）的親緣關(guān)系最為接近，同源性達95%。根據(jù)上述特征分析，菌種LA-Y09被確定為魯氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii），但其與NCBI數(shù)據(jù)庫中菌種的最高同源性僅為95%，可能是新發(fā)現(xiàn)的魯氏酵母菌，有待進一步證實。

2.3度對菌種生長的影響

在不同溫度下，菌種LA-Y09的生長情況如圖4所示。菌種LA-Y09在以辣椒為基料的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)溫度對菌體生長速度和生物量均有影響。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃、30℃和32℃時，菌種LA-Y 09都在24 h達到生長穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為26℃時，菌種LA-Y09生長速度稍慢，至30 h才達到穩(wěn)定。在上述不同溫度下，28℃條件下培養(yǎng)的菌體數(shù)最大，達到4.98×108CFU/g，其對數(shù)值為8.69。上述結(jié)果表明，菌種LA-Y 09生長的最適溫度為28℃，這與其他文獻報道是一致的［14］。

圖4　不同溫度對菌體生長的影響Fig.4 Effectof different tem perature on strain growth

2.4度對菌種生長的影響

圖5　不同鹽度下菌體生長情況Fig.5 Effectof different salt concentration on strain grow th

在不同鹽度的培養(yǎng)基中，菌種LA-Y09的生長情況如圖5所示。當(dāng)培養(yǎng)基的NaCl含量為4%時，菌體數(shù)略高于對照培養(yǎng)基，這表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaCl對菌種LA-Y09生長無影響。隨著培養(yǎng)基中NaCl含量繼續(xù)增大，菌體生長受到抑制的程度也逐漸增大。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至12%時，菌體數(shù)最大值仍可達108CFU/g的數(shù)量級（對數(shù)值8.69）；但是，質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%NaCl條件下的菌體數(shù)只能達到107CFU/g的數(shù)量級（對數(shù)值＜7.88），說明此鹽度的抑制作用較為嚴(yán)重。據(jù)文獻報道［15］，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時，一些耐鹽酵母雖可存活，但其生長已受到明顯的抑制。在本實驗中菌種LA-Y 09在質(zhì)量分?jǐn)?shù)達12%的培養(yǎng)基中仍有較高菌體數(shù)，因此該菌株具有較強的耐鹽性，適合用于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于12%的調(diào)味品的發(fā)酵生產(chǎn)。

2.5椒醬發(fā)酵的香氣成分分析

表3　辣椒基料發(fā)酵前后的主要揮發(fā)性成分比較Table 3 Com parison ofmain volatile com ponents in chillisubstrate before and after ferm entation

利用菌種LA-Y 09在含8%NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵前后的主要揮發(fā)性成分如表3所示。由于菌種LA-Y09利用了蔗糖和辣椒醬一些組分進行生長和代謝，導(dǎo)致發(fā)酵前后的培養(yǎng)基中主要揮發(fā)性成分有很大差異。辣椒基料中丙酮、糠醛、2-己烯-1-醇、1，4-二甲基環(huán)己烷、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇和正壬醛等揮發(fā)性組分含量較高，占總揮發(fā)成份比例76.11%，經(jīng)過發(fā)酵變得微量或未能檢出。新生成的揮發(fā)性成分包括正丙醇、異丁醇、正丁醇、正丙酸乙酯、乙酸異丁酯、2，3-丁二醇、1，3-丁二醇、丁酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、正己酸乙酯、3-甲基-1-丁醇丙酸酯、2-甲基丙酸正戊酯、苯乙醇、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙醇乙酸酯和2-甲基丁酸-2-苯乙酯等，占總揮發(fā)成份比例50.53%。發(fā)酵醪的香氣特征是各種揮發(fā)性成分協(xié)同作用的效果，其中苯乙醇、苯乙酸乙酯和苯乙醇乙酸酯呈現(xiàn)較明顯的蜜香特征，占總揮發(fā)成份比例28.95%。乙酸乙酯、正丙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯等酯類對果香特征均具有不同程度的貢獻。

3　結(jié)論

從自然發(fā)酵的辣椒醬中，篩選獲得1株生香能力較強的菌種LA-Y09。經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化特征和18S rDNA分子生物學(xué)特征等方面分析，該菌種被鑒定為魯氏酵母（Saccharomycesrouxli）。菌種LA-Y09的最適生長溫度為28℃，并在含12%NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長良好。菌種LA-Y09在含8%NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中、28℃發(fā)酵3 d后，發(fā)酵醪香氣濃郁，發(fā)酵前后的揮發(fā)性組分有很大差別，新生成了多種呈現(xiàn)蜜香和果香的香氣成分，如苯乙醇、苯乙酸乙酯和苯乙醇乙酸酯，占總揮發(fā)成份比例28.95%。菌種LA-Y09具有良好的生香特性和耐鹽特性，有望在辣椒醬發(fā)酵中得到應(yīng)用，但仍需進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝。

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Screening and identification ofa flavor-producing yeastand its influenceon chillisauce fermentation

LIMengya，DENGMaocheng*，LIJing，WANG Yao，CHENWeixin，LIANG Zengzhang
（Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China）

To obtain flavor-producing yeast for chillisauce fermentation，strains were screened from the natural fermented chilli sauce.Meanwhile，themorphological characteristics，grow th characteristicsof the strain and culturemedia for strain fermentation were also studied.A flavor-producing yeast LA-Y09was isolated and identified asSaccharomyces rouxii，and theoptimal culture temperature foryeast LA-Y09was28℃.Therewasstilla high numberofbacteria in culturemedium containing NaCl12%，which indicated that LA-Y09 showed thesalt-tolerance.In addition，avarietyofhoney and fruitaroma componentswereproduced in chillisubstratew ith NaCl8%，andm ixing flavorof the fermented chillimashwasimproved obviously.

flavor-producing yeast；chillisauce；screening；salt tolerant

TS26

0254-5071（2016）01-0100-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．022

2015-11-22

2015年度廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項資金重點項目（156021）；湛江市科技計劃項目（2014A 03001）；創(chuàng)新強校工程專項資金項目（1A20201、1A10205、1A20105、1A30205）；廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項目（GCZX-B1103）

李夢雅（1994-），女，大專生，研究方向為生物工程。

鄧毛程（1971-），男，教授，博士，研究方向為生物工程。