李　憑，石婷婷，肖冬光（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

二次發(fā)酵降低葡萄酒中雙乙酰的含量

李憑，石婷婷，肖冬光*
（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

該文通過在葡萄酒發(fā)酵后期添加蔗糖，促使酵母進(jìn)行二次發(fā)酵降低雙乙酰的含量。結(jié)果表明，二次發(fā)酵的最適加糖量為28 g/L，與常規(guī)發(fā)酵相比，二次發(fā)酵后雙乙酰含量降低了29.87%；在此基礎(chǔ)上，對酵母菌株WY1、WY1-1、WY1-2和WY1-12進(jìn)行加糖二次發(fā)酵試驗(yàn)，測定出4株菌均可降低發(fā)酵液中雙乙酰的含量，其中菌種WYI-12的發(fā)酵液中雙乙酰的含量最低，為4.05mg/L，比常規(guī)發(fā)酵降低了37.21%，改善了葡萄酒的感官質(zhì)量。

葡萄酒；二次發(fā)酵；雙乙酰

雙乙酰是葡萄酒中一種重要的風(fēng)味物質(zhì)。適量的雙乙酰會增加葡萄酒的香氣，改善葡萄酒的風(fēng)味。一般情況下，當(dāng)葡萄酒中雙乙酰含量為1～4mg/L時，可增加葡萄酒的口感及風(fēng)味復(fù)雜性，呈現(xiàn)悅?cè)说狞S油味或奶酪味；當(dāng)含量超過5～7mg/L時，就可能產(chǎn)生令人生厭的“餿飯味”，葡萄酒表現(xiàn)變質(zhì)跡象［1-2］。不同的酒體中雙乙酰的感覺閾值有所不同，其不僅與消費(fèi)者的喜好有很大的相關(guān)性［3］，而且很大程度上依賴于葡萄酒中存在的其他成分［4-5］，如MARTINEAU B等［6］報道的紅葡萄酒中雙乙酰出現(xiàn)“餿飯味”的閾值為10mg/L，而BARTOWSKY E J等［7］報道赤霞珠紅葡萄酒雙乙酰的閾值為2.8mg/L。由于雙乙酰的風(fēng)味閾值較低，在生產(chǎn)實(shí)踐中，除了合理的生產(chǎn)工藝，還必須考慮雙乙酰的生成途徑與消除方法。

雙乙酰是丙酮酸到2，3-丁二醇還原過程的中間產(chǎn)物，由α-乙酰乳酸氧化脫羧形成［8］。在葡萄酒釀造過程中雙乙酰的產(chǎn)生機(jī)制主要有酵母菌主導(dǎo)的酒精發(fā)酵和乳酸菌引發(fā)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）（簡稱蘋-乳發(fā)酵）。在酒精發(fā)酵過程中，雙乙酰的產(chǎn)生主要有3條途徑：其一是由糖酵解的中間產(chǎn)物—丙酮酸酶促產(chǎn)生；其二是由α-乙酰乳酸分泌到胞外基質(zhì)中，由非酶氧化脫羧反應(yīng)而直接形成［9］；其三是與酵母的纈氨酸生物合成有關(guān)［10］。乳酸菌在蘋-乳發(fā)酵中，L-蘋果酸除了轉(zhuǎn)化為L-乳酸外，還轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸脫羧生成活性乙醛-焦磷酸硫胺素復(fù)合物（thiamine pyrophosphate，TPP-C2*），后者再與丙酮酸生成α-乙酰乳酸，經(jīng)氧化脫羧生成雙乙酰；TPP-C2*也可再生成乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA），后者與TPP-C2*結(jié)合，直接生成雙乙酰［11］。

雙乙酰是葡萄酒釀造過程中酒精發(fā)酵和蘋-乳發(fā)酵的副產(chǎn)物，一般只進(jìn)行酒精發(fā)酵的葡萄酒中雙乙酰的含量都在閾值以內(nèi)，但是口感較差。蘋-乳發(fā)酵能夠降低葡萄酒的酸度，增加細(xì)菌穩(wěn)定性的同時，還會增加葡萄酒口味和香氣復(fù)雜性，改變其風(fēng)味。而經(jīng)過蘋-乳發(fā)酵后，葡萄酒中雙乙酰含量會得到很大提高，以至于超過葡萄酒規(guī)定的閾值。釀酒酵母不僅具有雙乙酰的合成能力，還有較強(qiáng)的還原能力［12］，將雙乙酰還原為乙偶姻，進(jìn)一步還原成2，3-丁二醇，后兩者在葡萄酒中的感官閾值很高，分別為150mg/L和600mg/L，因此對葡萄酒風(fēng)味影響不大［13］。本研究旨在不改變葡萄酒蘋-乳發(fā)酵特征的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步降低葡萄酒中雙乙酰的含量。通過在葡萄酒后期發(fā)酵過程中添加蔗糖，使酵母進(jìn)行二次發(fā)酵的方法降低雙乙酰的含量，同時比較不同菌株采用加糖二次發(fā)酵后雙乙酰的降解效果，篩選發(fā)酵性能良好并且可降低雙乙酰含量的優(yōu)良菌株，以更好地提高葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株

葡萄酒酵母（Saccharomyces ellipsoideus）WYI、WYI-1（WYI改造菌株，過表達(dá)雙乙酰還原酶基因bdh1）、WYI-2（WYI改造菌株，過表達(dá)雙乙酰還原酶基因bdh2）和WYI-12（WYI改造菌株，同時過表達(dá)雙乙酰還原酶基因bdh1和bdh2）、乳酸菌（lactic acid bacteria）：工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextract peptonedextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，pH 6.0。

1.1.3料及化學(xué)試劑

玫瑰香葡萄：天津漢沽葡萄園；蔗糖：上海試劑二廠；鄰苯二胺（分析純）：天津市四通化工廠；雙乙酰（98%）：天津市化學(xué)試劑一廠；濃鹽酸（38%）：北京化工廠。

1.2器與設(shè)備

UVm ini-1240分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；ETT-SYXZL雙乙酰蒸餾裝置、IS-RDS3恒溫?fù)u床：上海制成儀器制品有限公司；JW-JJJ-3酒精計(jì)：天津市津武儀器儀表有限公司；pHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)：上?？茖W(xué)儀器有限公司；PERKIN ELMERAutosystem氣相色譜儀：北京安捷倫科技有限公司。

1.3法

1.3.1萄酒加工工藝流程

操作要點(diǎn)：將葡萄分選除雜后進(jìn)行破碎除梗，同時加入50～100mg/L SO2（添加量根據(jù)葡萄的損壞程度而定），用蔗糖調(diào)整葡萄漿的糖濃度，固定pH值為3.3，接入5%酵母菌，在25℃條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵4 d，發(fā)酵液進(jìn)行皮渣分離后，接入5%乳酸菌，于18℃進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵，為啟動酵母二次發(fā)酵，在蘋-乳發(fā)酵4 d后于發(fā)酵液中添加蔗糖（添加量和前期蔗糖添加量總和為210 g/L），二次發(fā)酵4 d后結(jié)束發(fā)酵，對發(fā)酵液進(jìn)行過濾、貯存后殺菌裝罐。

1.3.2次發(fā)酵加糖量的確定

葡萄酒發(fā)酵時，葡萄汁含糖量必須在17%以上才能生成10%vol的酒，只有10%vol以上的酒才能保存長久。如糖分不足，則需要人為提高原料的含糖量，從而提高葡萄酒的酒精度。一般要求葡萄汁的初始糖含量≥200 g/L，在常規(guī)葡萄酒發(fā)酵過程中，一般將葡萄汁的初始含糖量調(diào)整為210 g/L。為確保葡萄酒發(fā)酵液的殘?zhí)呛途凭仍谝?guī)定范圍內(nèi)，以及驗(yàn)證酵母在二次加糖后是否啟動二次發(fā)酵，故在加糖二次發(fā)酵時，使初始糖含量和二次加糖量的總量仍為210 g/L。

按照表1，將葡萄汁初糖含量分別調(diào)至相應(yīng)的值，于25℃條件下接入酵母WY1進(jìn)行酒精發(fā)酵，對發(fā)酵液進(jìn)行皮渣分離，接入乳酸菌進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵，待后發(fā)酵4 d后，按表1于發(fā)酵液中加入蔗糖進(jìn)行發(fā)酵。通過測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?、酒精度和雙乙酰含量，以確定葡萄酒二次發(fā)酵的最適加糖量。

表1　葡萄酒二次發(fā)酵加糖量Table 1 Sugar addition during w ine secondary ferm entation

1.3.3同菌株加糖發(fā)酵試驗(yàn)

按照1.3.1對葡萄汁成分進(jìn)行調(diào)整之后，將待篩選菌株WYI、WYI-1、WYI-2和WYI-12分別加入發(fā)酵液中進(jìn)行葡萄酒常規(guī)發(fā)酵和加糖二次發(fā)酵，測定兩種發(fā)酵方式條件下各發(fā)酵液的基本釀造指標(biāo)（pH值、總酯含量和風(fēng)味物質(zhì)），并進(jìn)行比較，同時測定加糖二次發(fā)酵后各發(fā)酵液中雙乙酰的含量。

1.3.4析方法

酒精度采用酒精計(jì)法測定［14］；殘?zhí)橇康臏y定采用菲林試劑法測定［14］；pH值采用pH計(jì)測定；總酯含量的測定采用皂化法測定［14］；風(fēng)味物質(zhì)采用高效氣相色譜法測定；雙乙酰含量的測定采用鄰苯二胺比色法［15-16］。

2　結(jié)果與分析

2.1次發(fā)酵加糖量的確定

2.1.1次加糖量對葡萄酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊?/p>

以二次發(fā)酵不加糖的發(fā)酵液作為對照，在不同的加糖量條件下進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵試驗(yàn)。為驗(yàn)證葡萄酒發(fā)酵前期和加糖后酵母的發(fā)酵能力以及加糖量對葡萄酒發(fā)酵的影響，分別在前期發(fā)酵結(jié)束后（第4天）和加糖二次發(fā)酵結(jié)束后（第12天）測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢途凭?，以確定葡萄酒二次發(fā)酵的最適加糖量，二次發(fā)酵中加糖量對葡萄酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊懡Y(jié)果分別見表2和表3。

表2　二次發(fā)酵中加糖量對發(fā)酵液殘?zhí)橇康挠绊慣able 2 Effect of sugar addition on residual sugar of fermentation liquid in seconda ry ferm entationg/L

由表2可知，隨著二次加糖量的增多，初始加糖量的減少，最后發(fā)酵液的殘?zhí)橇砍尸F(xiàn)由小變大的趨勢。當(dāng)二次加糖量為42 g/L和56 g/L時，與二次發(fā)酵不加糖的發(fā)酵液相比，發(fā)酵液中殘?zhí)橇棵黠@增加，說明二次加糖后酵母幾乎沒有發(fā)酵。后期發(fā)酵乳酸菌會消耗一部分蔗糖使酒精度下降，同時由于后期發(fā)酵溫度較低，酵母菌酒精發(fā)酵速度慢，也會導(dǎo)致發(fā)酵液殘?zhí)瞧摺?/p>

表3　二次發(fā)酵中加糖量對發(fā)酵液酒精度的影響Tab le 3 Effect of sugar addition on alcohol content of ferm entation liquid in secondary ferm entation

由表3可知，當(dāng)二次加糖量為14 g/L和28 g/L時，與前期發(fā)酵相比，發(fā)酵后的酒精度有所增加。隨著二次加糖量的增多，初始加糖量的減少，二次發(fā)酵液的酒精度呈現(xiàn)由大變小的趨勢。這可能是由于初始加糖量較少，酵母可利用的糖不足，酵母發(fā)酵能力弱，即使在后期發(fā)酵過程中加糖，激活起來的酵母量也相應(yīng)較少，使后期加的糖不能被利用而積累到最后，導(dǎo)致最后酒精度明顯降低。

結(jié)果表明，按照國標(biāo)GB 15077—2006《葡萄酒》干型葡萄酒的要求（殘?zhí)橇俊?.0g/L，酒精度在8.5%vol～15.0%vol）內(nèi)。因此，綜合考慮，初步確定二次發(fā)酵加糖量為14 g/L和28 g/L。

2.1.2糖二次發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵雙乙酰含量比較

在前期發(fā)酵及加糖二次發(fā)酵（第12天）結(jié)束后測定兩種加糖量條件下發(fā)酵液中雙乙酰含量，并與不加糖常規(guī)發(fā)酵進(jìn)行比較，確定葡萄酒二次發(fā)酵的最適加糖量，結(jié)果見圖1。

圖1　二次發(fā)酵加糖量對發(fā)酵液中雙乙酰含量的影響Fig．1 Effectof sugar addition on diacetylcontentof fermentation liquid in secondary fermentation

由圖1可知，加糖二次發(fā)酵后，發(fā)酵液中雙乙酰含量比常規(guī)蘋-乳發(fā)酵明顯降低，其中常規(guī)發(fā)酵時發(fā)酵液雙乙酰含量為11.35mg/L，二次加糖量為14 g/L和28 g/L時，發(fā)酵液中雙乙酰含量分別為9.72mg/L和7.96mg/L，與常規(guī)蘋-乳發(fā)酵相比，雙乙酰含量分別降低了14.36%和29.87%。后期加糖使酵母產(chǎn)生二次發(fā)酵，提高了其對發(fā)酵液中雙乙酰的還原活性，使雙乙酰含量降低。加糖量為28 g/L與14 g/L相比，較多的糖用于后期發(fā)酵，使酵母二次發(fā)酵更充分。同時，當(dāng)酵母與乳酸菌同時發(fā)酵時，二者具有相互抑制的作用，酵母對雙乙酰還原的同時，還使得乳酸菌代謝的雙乙酰量較少。故確定二次發(fā)酵的最適加糖量為28 g/L。

2.1.3糖二次發(fā)酵與常規(guī)蘋-乳發(fā)酵發(fā)酵的常規(guī)指標(biāo)的比較

為考察加糖二次發(fā)酵對葡萄酒中其他釀造指標(biāo)的影響，按照方法1.3.4對該加糖量條件下的發(fā)酵液的pH值、總酯和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，并與酒精發(fā)酵后和常規(guī)蘋-乳發(fā)酵后的相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果見表4。

表4　葡萄酒pH值、總酯含量和風(fēng)味物質(zhì)的測定Table 4 Determination of pH，totalester contentand flavor com pounds in w ine

由表4可知，加糖二次發(fā)酵后發(fā)酵液中pH值、總酯含量和風(fēng)味物質(zhì)含量與常規(guī)發(fā)酵相比略有偏差，但變化不大。葡萄酒中乳酸菌發(fā)酵可以起到降酸的作用，在發(fā)酵后期加糖后促使酵母進(jìn)行二次發(fā)酵，對乳酸菌有一定的抑制作用，使最后發(fā)酵液的pH值與常規(guī)蘋-乳發(fā)酵相比略有增大，但影響不大。后期乳酸菌發(fā)酵在調(diào)節(jié)發(fā)酵液“酸堿平衡”的同時，其代謝活動也會改變葡萄酒中的酯類和一些高級醇等風(fēng)味物質(zhì)的含量，對葡萄酒的風(fēng)味起到一定的修飾作用，提高葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性。加糖量為28 g/L的加糖二次發(fā)酵綜合了酒精發(fā)酵和常規(guī)蘋-乳發(fā)酵的優(yōu)勢，既降低了葡萄酒中雙乙酰的含量，又使葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，提高了葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量。

2.2產(chǎn)雙乙酰葡萄酒釀酒酵母的篩選

2.2.1同菌株對雙乙酰含量的影響

以葡萄酒酵母WYI作為對照，考察改造菌株WYI-1、WYI-2和WYI-12加糖二次發(fā)酵后對發(fā)酵液中雙乙酰含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　不同菌株對葡萄酒發(fā)酵雙乙酰含量的影響Fig.2 Effectof different strains on diacetyl contentofw ine

由圖2可知，葡萄酒酵母WYI、WYI-1、WYI-2和WYI-12在加糖二次發(fā)酵后，發(fā)酵液中雙乙酰含量分別為7.60mg/L、4.57mg/L、5.06mg/L和4.05mg/L。與常規(guī)發(fā)酵相比分別降低了33.04%、41.63%、41.43%和37.21%；改造菌株與菌株WY1相比，在加糖二次發(fā)酵的基礎(chǔ)上，改造菌分別使雙乙酰含量進(jìn)一步降低了39.87%、33.42%和46.71%。由于改造菌株在WY1的基礎(chǔ)上提高了雙乙酰還原酶的還原能力，可使雙乙酰更多的還原為乙偶姻和2，3-丁二醇。改造菌WYI-1、WYI-2和WYI-12均能更好的加快雙乙酰的降解，其中菌株WY1-12的降解效果最好。

2.2.2同菌株二次發(fā)酵性能的比較

以菌株WY 1作為對照，分別考察突變菌WY 1-1、WY 1-2和WY1-12發(fā)酵后對葡萄酒釀造指標(biāo)的影響，結(jié)果見表5。

由表5可知，菌株WY1-1經(jīng)加糖二次發(fā)酵后發(fā)酵液的殘?zhí)橇俊⒕凭取H值及其中的總酯和風(fēng)味物質(zhì)與菌株WY 1發(fā)酵結(jié)果基本一致；菌株WY 1-2發(fā)酵后發(fā)酵液的殘?zhí)橇俊⒕凭群蚿H值與菌株WY1相差不大，但總酯和風(fēng)味物質(zhì)明顯降低。而突變株WY1-12發(fā)酵后發(fā)酵液的殘?zhí)橇亢蚿H值降低，酒精度升高的同時，總酯和風(fēng)味物質(zhì)含量明顯升高，由于酯類也是葡萄酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)，較多的酯類有助于提高葡萄酒的風(fēng)味，且風(fēng)味物質(zhì)在葡萄酒的呈香過程中起到至關(guān)重要的作用。故綜上可得，菌株WY1-12的發(fā)酵性能較好。

表5　不同菌株對葡萄酒釀造指標(biāo)的影響Tab le 5 Effectof different strains on brew ing indexes in w ine

3　結(jié)論

本研究通過在葡萄酒常規(guī)蘋-乳發(fā)酵的基礎(chǔ)上，于葡萄酒后期發(fā)酵過程中添加蔗糖，使酵母菌進(jìn)行二次發(fā)酵降低雙乙酰的含量。結(jié)果表明，加糖二次發(fā)酵的最適加糖量為28 g/L，與常規(guī)發(fā)酵相比，該加糖量下進(jìn)行二次發(fā)酵后雙乙酰含量降低了29.87%。在此基礎(chǔ)上對菌株WY1改造后提高了雙乙酰還原酶活力的菌株WY1-1、WY1-2和WY 1-12進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵試驗(yàn)，篩選出一株發(fā)酵性能良好并且對雙乙酰降解效果較好的菌株WY 1-12，與菌株WY 1相比，在加糖二次發(fā)酵的基礎(chǔ)上，該菌使雙乙酰含量進(jìn)一步降低了46.71%，并且對發(fā)酵液的其他釀造指標(biāo)沒有顯著影響。加糖二次發(fā)酵綜合了酒精發(fā)酵和蘋-乳發(fā)酵的優(yōu)勢，既降低了葡萄酒中雙乙酰的含量，同時使葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，使酒變得圓潤、柔和，對提高葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量具有十分重要的意義。

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Reduction of diacetyl inw ine through secondary fermentation

LIPing，SHITingting，X IAO Dongguang*
（Tianjin Key Laboratory of IndustrialM icrobiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry ofEducation，College ofBiotechnology，Tianjin University ofScienceand Technology，Tianjin 300457，China）

Diacetyl content was reduced through yeast secondary fermentation w ith sugar addition into w ine during post fermentation.The results showed that the diacetyl content reduced by 29.87%at theoptimum sugar content28 g/L during secondary fermentation.On thebasisof theoptimum sugar content，the secondary fermentation of w inew ith sugar addition was carried outw ith yeast strainsWYI，WYI-1，WYI-2 and WYI-12.The experiments results indicated that four strains all could reduce the diacetyl content in fermentation liquid.The diacetyl content in strainWYI-12 fermentation liquid was the lowest（4.05mg/L），reduced 37.21%com pared w ith the conventional fermentation，which im proved sensory quality ofw ine.

w ine；secondary fermentation；diacetyl

Q815

0254-5071（2016）01-0115-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．025

2015-11-05

天津市科技支撐計(jì)劃（15ZCZDNC00110）

李憑（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代釀造技術(shù)。

肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代釀造技術(shù)。