李　莎，雷智棋，朱　紅，張志清（.四川農業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 6504；.重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶 408000）

HPLC同時檢測酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O色譜條件優(yōu)化

李莎1，2，雷智棋2，朱紅2，張志清1*
（1.四川農業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625014；2.重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶 408000）

該研究建立高效液相色譜法同時檢測食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的方法，對高效液相色譜中色譜柱、柱溫、流動相種類及比例、流速、波長等影響因素進行了研究及優(yōu)化，得到色譜檢測條件為：色譜柱為Kromasil C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相為甲醇-50mmol/L乙酸銨溶液=50∶50（V/V）；流速：1.0mL/min；檢測波長450 nm；柱溫35℃。在此最佳條件下，堿性嫩黃O及酸性橙Ⅱ的分離度好，且峰型正常。結果表明，該方法適合食品中堿性嫩黃O及酸性橙Ⅱ的檢測。

食品；酸性橙Ⅱ；堿性嫩黃O；高液相色譜法

食用色素是以食品著色、改善食品的色澤為目的的食品添加劑，因其能賦予食品美好的外觀而得以廣泛添加［1］。酸性橙Ⅱ作為常用的酸性偶氮染料，早在20世紀初，科學家就發(fā)現用偶氮類化合物猩紅色素喂養(yǎng)動物的肝癌發(fā)病率是100%，對人體危害極大。AM INK A等［2］研究發(fā)現，偶氮類染料不管是高劑量還是低劑量都會對人體產生不利的影響，并改變人體生化指標危害重要的器官，如肝、腎等。偶氮化合物在體內分解，可形成芳香胺化合物，芳香胺在體內經過代謝活動后與靶細胞作用而可能引起癌腫［3］。該染料如果在食品加工過程中使用就會污染食品成品，食用后可能會引起食物中毒，如果在長期食用的情況下，有可能對將來的生育造成影響，如不孕或者畸形兒，對自身健康也有影響，其為中等毒性致癌化合物，因此嚴格禁止在食品中使用［4-5］。夏立婭等［6］在國內某些品牌的辣椒面產品中檢測出非法添加的非食用色素酸性橙Ⅱ。

堿性嫩黃O是一種芳香胺類堿性工業(yè)染料，一般用于腈綸、人造纖維、皮革、紙等的染色和棉織品、絲織品的印花［7］。在中性及偏堿性條件下，堿性嫩黃O與蛋白質吸附作用較強，不易褪色，一些不法商人將其加入食品及飼料中以改變產品的色澤來增加經濟收入：漁民以及部分個體商戶將黃魚和腐竹侵染在含有堿性嫩黃O的液體中，使黃魚和腐竹外表美觀，達到以次充鮮、抬高價格等作用［8-9］。部分糖果和飲料中添加堿性嫩黃O用于維護和改善食品的外觀顏色，以迎合消費者達到盈利目的［10］。毒理學資料表明堿性嫩黃O對人體皮膚黏膜有輕度刺激的危害，人接觸或者吸入堿性嫩黃O可引起結膜炎、皮炎和上呼吸道刺激等癥狀，嚴重則引起中毒，長期接觸甚至會致畸致癌［11］，因此被嚴禁作為食品添加劑使用［12］。

目前，國內外檢測食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的方法主要有薄層色譜掃描法、示差分析法、超高效液相色譜-質譜法（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）、氣相色譜-質譜-離子掃描聯用（gaschromatography-massspectrometry/selectedionscan，GCMS/SIM）、液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）等。薄層分離-紫外吸收分光光度法設備簡單，可操作性強，但是靈敏度不高［13］；UPLC-MS、GC-MS/SIM、LC-MS/MS這類方法雖然分析時間短，而且靈敏度高，檢出限低，但是需要昂貴的液相色譜及高分辨率的質譜儀，而且這類方法對實驗操作人員要求較高，并不適合普及性的大面積使用［14-15］；電化學方法通常設備簡單，環(huán)境污染小，但是此類方法不易區(qū)分結構類似物［16］。近年來隨著高效液相色譜儀的普及，并且它本身具有靈敏度高，分辨率高，檢測結果精確的優(yōu)點，而被廣泛的應用于分析檢測實驗中?，F有的高效液相色譜法檢測食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的方法多采用梯度洗脫，分段波長的檢測方法［17-18］，這類方法操作復雜，儀器設備要求高，實驗花費大［19］，不適應方法的普及和日常監(jiān)管。

本研究的目的是建立在“等梯度，恒定波長”的條件下同時快速檢測食品中酸性橙Ⅱ、堿性嫩黃O這2類非食用色素的高效液相色譜檢測方法，相較于現階段通用的梯度洗脫，分段波長的檢測方法分析更快速準確，實際操作更簡單，對實驗人員要求和儀器條件要求更低，同時本研究對建立的液相檢測條件進行優(yōu)化，主要包括波長、柱溫、流動相和流速等，以探討出結果可靠、靈敏度高、精密度高的最佳液相檢測條件。

1　材料與方法

1.1料與試劑

酸性橙Ⅱ標準品、堿性嫩黃O標準品：上海金穗生物科技有限公司；甲醇：上海科頓企業(yè)技術咨詢有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、乙酸銨（優(yōu)級純）：成都市科龍化工試劑廠。本實驗所測定食品樣品均購于四川省雅安市蒼抨路菜市場。

1.2器與設備

Shimadzu10A高效液相色譜儀：日本島津公司；UV-3000紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；M illipore M illi-Q型純水儀：美國M illipore公司；Sartorius CP225D型電子天平：德國Sartorius公司。

1.3驗方法

1.3.1佳吸收波長

用紫外可見分光光度計分別對0.1 g/L堿性嫩黃O標準溶液、0.1 g/L酸性橙Ⅱ標準溶液、20mg/L酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的混合標準溶液進行波段掃描（400～700 nm），可知堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的各自最佳吸收波段，酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的混合標準溶液的最大吸收波長，根據兩種非食用色素的紫外吸收曲線，及混合物的最大吸收波長初步確定色譜檢測的最佳吸收波長X0nm。

1.3.2動相的選擇

參考林賽君等［20］的研究結果，實驗初步選擇的流動相為以下3種：甲醇-20mmol/L乙酸銨水溶液=75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、50∶50（V/V），甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液=75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50（V/V），乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液=75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45（V/V）。

在流速1.0m L/m in、檢測波長X0nm、柱溫35℃的條件下，準確注入10μL的混合標準品溶液，分別采用上述3種流動相的不同比例對標準溶液作等度洗脫，分析混合標準品的色譜圖，確定流動相的最佳檢測體積比例。

1.3.3溫的選擇

在流速1.0m L/min，進樣量10μL，檢測波長X0nm的條件下，按照確定的流動相試驗，準確注入10μL的混合標準品溶液，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃柱溫條件下，分析混合標準品的色譜圖，確定檢測此兩種物質的最佳柱溫。

1.3.4速的選擇

在進樣量10μL，檢測波長X0nm，檢測溫度T的條件下，按照確定的流動相試驗，準確注入10μL的混合標準品溶液，分別在1.0m L/min、0.9m L/min、0.8m L/min、0.7m L/min的流速條件下，分析混合標準品的色譜圖，確定檢測此兩種物質的最佳流速。

1.3.5測固定波長的確定

以上述實驗的結果來確定柱溫、流動相等條件，流動相流速為1.0m L/min，在此系統(tǒng)下準確注入10μL的混合標準品溶液，實驗檢測波長分別為X0-15 nm、X0-10 nm、X0-5 nm、X0nm、X0+5 nm、X0+10 nm、X0+15 nm的條件下，分析混合標準品的色譜圖，以兩種非食用色素總的峰面積大小作為評價指標，并綜合考慮單色素的蜂面積大小，最終確定檢測此兩種物質的最佳波長。

2　結果與分析

2.1佳吸收波長的初選

圖1　堿性嫩黃O標準溶液（A），酸性橙Ⅱ標準溶液（B）及混標（C）的紫外吸收掃描結果Fig．1 UV absorption scanning results of auramine O（A），acid orange II（B）standard so lution and m ixed standard solution（C）

用紫外可見分光光度計分別對0.1 g/L堿性嫩黃O標準溶液、0.1 g/L酸性橙Ⅱ標準溶液、20mg/L酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的混合標準溶液進行波段掃描，結果如圖1所示。由圖1可知，堿性嫩黃O在波長430 nm處吸光度值最高，酸性橙Ⅱ在波長480 nm處吸光度值最高，混合標準溶液在波長430 nm處達到最高，但是堿性嫩黃O以及混合標準溶液在波長450 nm之后吸光度值落差較大，綜合考慮，初選450 nm為檢測波長。

2.2動相的優(yōu)化

選用Kromasil C18（4.6mm×150mm，5μm）色譜柱，在流速為1.0m L/min，檢測波長為450 nm，柱溫為30℃的條件下對混合標準溶液在不同流動相及比例下進行高效液相色譜檢測。本實驗主要選擇了以下流動相及比例進行試驗∶甲醇-20mmol/L乙酸銨水溶液=75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、50∶50（V/V），甲醇-50mmol/L乙酸銨水溶液=75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50（V/V），乙腈-10mmol/L乙酸銨水溶液=75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45（V/V），結果如圖2所示。

圖2　混合標準溶液在不同流動相及比例條件下的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram ofm ixed standard so lution under the conditions of differentmobile phase and proportion

由圖2可知，當選用甲醇-20mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，調節(jié)流動相比例，酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O無法有效分離；當選用乙腈-10mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，堿性嫩黃O標準品溶液中的雜質會形成多個有效峰，雜質峰與堿性嫩黃O的峰分離難度增加，而且在此流動相條件下，酸性橙Ⅱ的峰提前，與雜質峰連接在一起，導致酸性橙Ⅱ與雜質峰也難以分離，且酸性橙Ⅱ出峰時間太早，易導致其與樣品的雜質峰混合，因此該流動相不考慮；當選用甲醇-50mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，通過調節(jié)流動相比例，發(fā)現當甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液= 55∶45（V/V）和甲醇-50mmol/L乙酸銨水溶液=50∶50（V/V）時，標準品雜質峰與酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O可以有效分離，但是因為在流動相為甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液= 55∶45（V/V）時，酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O出峰時間相對較早，易導致樣品雜質峰與目標峰的重疊，因此選用流動相為甲醇-50mmol/L乙酸銨水溶液=50∶50（V/V），在此條件下，混合標準溶液的高效液相色譜檢測結果見圖3。由圖3可知，堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的理論塔板數分別為3021和9084，峰底寬分別為0.477和0.435，分離度分別為5.62和7.11，且峰型正常，無拖尾現象。

圖3　最佳流動相條件下混合標準品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC ch rom atogram ofm ixed standard solution under the optimalmobile phase conditions

2.3溫的優(yōu)化

圖4　不同柱溫條件下混合標準品溶液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram ofm ixed standard solution under different column tem perature conditions

在KromasilC18（4.6mm×150mm，5μm）色譜柱，流速1.0m L/m in，檢測波長450 nm，流動相甲醇-50mmol/L乙酸銨水溶液的固定條件下，調節(jié)柱溫（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）分別進行實驗，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著柱溫的增加，堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的出峰時間明顯提前，通過計算數據可知，在35℃時兩種非食用色素總峰面積最大，且此時各峰保留時間合適。綜合考慮對儀器的保護作用等因素，確定后續(xù)實驗柱溫為35℃。

2.4速的優(yōu)化

在KromasilC18（4.6mm×150mm，5μm）色譜柱，柱溫35℃，檢測波長450 nm，流動相甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液的固定條件下，調節(jié)流速（1.0m L/min、0.9m L/min、0.8m L/m in、0.7m L/min）分別進行實驗，結果如圖5所示。由圖5可知，流速越小，相同物質出峰時間越長，流速越大，相同物質出峰時間越短；當流速為1.0m L/m in時，目標峰與雜質峰已能完全分離，且不易與樣品中雜質峰疊加，因此選擇流速為1.0m L/min。

圖5　不同流速條件下混合標準品溶液高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chrom atogram ofm ixed standard solution under different flow rates conditions

2.5測固定波長的確定

圖6　不同波長條件下混合標準品溶液高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram ofm ixed standard solution under differentwave length conditions

在KromasilC18（4.6mm×150mm，5μm）色譜柱，柱溫35℃，流速1.0m L/m in流動相甲醇-50mmol/L乙酸銨水溶液的條件下調節(jié)檢測波長（435 nm、440 nm、445 nm、450 nm、455 nm、460 nm、465 nm）分別進行實驗，結果如圖6所示。由圖6可知，隨著波長的增加，堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的總峰面積不斷減少，但是酸性橙Ⅱ的峰面積不斷增加，考慮到酸性橙Ⅱ的響應值較低，因此在滿足兩種非食用色素總峰面積最大的同時，也應盡量滿足酸性橙Ⅱ的峰面積較大。由數據可觀察出，堿性嫩黃O在450 nm之后，峰面積減少幅度較大，總峰面積減少幅度也較大，綜合考慮兩種非食用色素的總峰面積以及單色素的峰面積，選用檢測波長為450 nm，在此條件下，兩色素總峰面積較大，單色素的峰面積也較大。

2.6佳色譜條件的確定

綜合上述試驗結果，得到最佳的液相色譜條件為Kromasil C18（4.6mm×150mm，5μm）色譜柱、35℃柱溫、1.0m L/min流速、450 nm波長、甲醇：50 mmol/L乙酸銨= 50∶50（V/V）為流動相。最佳條件下混合標準品高效液相色譜圖見圖7。由圖7可知，兩種非食用色素的保留時間、半峰寬、理論塔板數、分離度、拖尾因子、不對稱度等都達到最佳，且此時儀器對兩種非食用色素的相對吸收峰高都較好。

圖7　最佳條件下混合標準品高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram ofm ixed standard solution under the optimum conditions

2.7品驗證試驗

采用本方法對市售以及超市的豆制品（包括腐竹、豆干等）、肉制品（雞爪、真空包裝雞肉等）、鮮活類制品（黃魚、真空包裝黃魚等）、調味品（包括辣椒粉、豆瓣醬等）共40份樣品（如圖8）中的非食用色素進行了檢測，結果見圖8。由圖8可知，辣椒粉樣品中檢測到酸性橙Ⅱ含量為5.34mg/kg，小黃魚樣品中檢測到堿性嫩黃O含量分別為1.92mg/kg，其余樣品中未檢測出非食用色素。

分析結果表明，建立的HPLC同時測定食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O方法在12min內即可完成2種非食用色素的同時檢測。本方法具有快速、簡便、實用性強等特點。

圖8 辣椒粉（a）及黃魚（b）的HPLC色譜圖Fig．8 HPLC Chrom atog ram of chilli（a）and yellow c roaker（b）

3　結論

本試驗采用等梯度、定波長的方法來分離檢測食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O，建立方法過程中由于儀器與實驗方法改變的原因，初始階段嘗試了多種流動相的選擇，建立了同時檢測酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O這2種非食用色素的方法后并對該方法進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的檢測條件為：色譜柱為Kromasil C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相為甲醇-50mmol/L乙酸銨溶液=50∶50（V/V）；流速：1.0m L/m in；檢測波長450 nm；柱溫35℃。在上述條件下，堿性嫩黃O的保留時間為7.632m in，酸性橙Ⅱ的保留時間為11.548m in，堿性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的理論塔板數分別為3021和9084，峰底寬分別為0.477和0.435，分離度分別為5.62和7.11，且峰型正常，無拖尾現象。該方法下樣品重現性好，能在較短時間內完成2種物質的分離檢測，方法簡便易行。本方法比現有的研究方法操作更為簡便，對儀器和操作人員的要求低，精密度高，具有良好的分離度，測定結果可靠，靈敏度高，能滿足食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的含量測定。

隨著對食品中非食用色素不斷深入的研究，目前關于利用高效液相色譜檢測食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的方法也是多種多樣。本研究用高效液相色譜儀在等梯度、定波長的條件下分離并檢測食品中的這2種非食用色素，可滿足于市場上一般食品中酸性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的檢測。而且該方法更簡單、快捷，可在12min內完成2種非食用色素的檢測，且靈敏度高，適合推廣使用。

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Optim ization of simultaneousdetection ofacid orange IIand auramineO in food by HPLC

A method of simultaneous detection of acid orange IIand auram ine O in food by HPLC wasestablished.The influence factors including chromatographic column，column tem perature，the type and proportion ofmobile phase，flow rate and wavelength were researched and optimized. The chromatographic detection condition was obtained as follow s:chromatographic column K romasil C18（4.6 mm×150 mm，5μm），methanol -50mmol/L ammonium acetate（50∶50，V/V）asmobile phase，flow rate 1.0m l/min，determ inewavelength 450 nm，and column temperature 35℃. Under the optimum conditions，auram ine O and acid orange IIhad good separation degree and normal peak type.The resulted showed that the methodwassuitable fordetection ofauramineO and acid orange IIin food.

food；acid orange II；auramineO；HPLC

O657．7

0254-5071（2016）01-0165-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．037

LISha1，2，LEIZhiqi2，ZHU Hong2，ZHANGZhiqing1*

（1.College ofFood Science，Sichuan AgriculturalUniversity，Ya’an 625014，China；2.Chongqing Fuling Institute for Food and Drug Control，Chongqing 408000，China）

2015-11-17

四川農業(yè)大學?？h合作項目（0600H0300）

李莎（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。

張志清（1976-），男，博士，教授，研究方向為糧油副產物開發(fā)利用及食品檢驗。