武林賀，白新鵬，吳謙，徐小夢，馬若影，李雪（海南大學食品學院，海南?？?70228）

脂肪酶水解椰子油動力學研究

武林賀，白新鵬*，吳謙，徐小夢，馬若影，李雪
（海南大學食品學院，海南?？?70228）

椰子油；脂肪酶；水解；動力學

脂肪酶催化油脂水解生成油脂衍生物是一種高效、環(huán)保、低能耗的方法［1-2］，它是以酶作催化劑的酶解反應，這種反應是在溫和的條件下進行的，不會產(chǎn)生傳統(tǒng)的油脂水解產(chǎn)物顏色深、發(fā)生熱聚合等現(xiàn)象，而且具有選擇性，反應過程中不會發(fā)生腐敗變質(zhì)等現(xiàn)象，獲得的產(chǎn)物質(zhì)量較好，因此脂肪酶水解油脂的技術(shù)應用逐漸廣泛［3-4］。椰子油［5-7］富含多種飽和脂肪酸甘油酯，椰子油衍生物是由椰子油水解產(chǎn)生的［8-9］，其中月桂酸等飽和脂肪酸多用于食品和日用品領(lǐng)域，而且需求量日漸增大［10-11］。目前主要是用天然植物油脂皂化分離、高溫高壓分解和合成脂肪酸等方法生產(chǎn)月桂酸等飽和脂肪酸。這些方法不但成本較高，而且在生產(chǎn)中會出現(xiàn)脂肪酸的氧化分解、產(chǎn)品顏色較深等現(xiàn)象［12-13］。在國外利用脂肪酶水解油脂生產(chǎn)油脂衍生物的方法已經(jīng)應用到生產(chǎn)實踐當中，美國和意大利已經(jīng)利用脂肪酶水解牛油和亞麻油來生產(chǎn)脂肪酸，其生產(chǎn)成本低，得到的脂肪酸的質(zhì)量較好［14］。而我國使用脂肪酶水解油脂的技術(shù)起步較晚，尤其是脂肪酶水解椰子油

1　材料與方法

1.1材料

海南本地高種椰子；脂肪酶（20萬U/g）、纖維素酶（20萬U/g）、木瓜蛋白酶（20萬U/g）、β-葡聚糖酶（36萬U/g）：購自北京夢怡生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Anke（GL21GII）高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；Re（52）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZD（III）真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；HR（1724）型打漿機：珠海飛利浦家電公司；SHZ（B）恒溫水浴振蕩器：上海龍躍儀器有限公司；SHA（2）恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1椰子油的制備

采用水酶法制備椰子油，其工藝為采果、去椰衣、去種皮、打漿、酶解、滅酶、離心及干燥。將新鮮的椰子去椰衣和種皮后的椰肉破碎打漿，加入適量的水調(diào)節(jié)料液比，加入一定量的水解酶在一定的溫度下酶解一定的時間后進行離心分離，將分離出的油脂部分進行精煉處理得到椰子油。

1.3.2椰子油酸值的測定

將椰子油與水按一定比例混合，水浴加熱到反應所需溫度，快速加入一定量脂肪酶，用玻璃棒攪拌均勻后放入恒溫水浴振蕩器開始反應。為保證反應溫度恒定，每次取樣要少量快速。反應后的樣品經(jīng)離心分離、干燥后，測定其酸值的變化。

1.3.3酶解動力學的研究

1.3.3.1不同單因素條件對酶解速率的影響

研究底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度和酶解時間對脂肪酶水解椰子油的影響。試驗條件為底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度和酶解時間，在其它條件不變的情況下，分別改變酶解時間（20、40、60、80、100、120 min）、酶解溫度（45、50、55、60、65℃）、酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）和底物質(zhì)量濃度［0.2、0.4、0.6、0.8、1.0（g/mL）］，按1.3.2的方法進行酶解試驗，測定酶解后的原生態(tài)椰子油的水解率，按照式（1）計算酸值變化速率，即反應速率v［mg/（g·mL·min）］：

式中：A為酸值，mg/g；V為反應體積，mL；t為反應時間，min。

1.3.3.2酶解動力學模型的建立

Michaelis-Menten對酶解反應做了兩步假設(shè)，即酶與底物的酶促反應按下面反應步驟進行：

式中：k1為ES生成的反應速率常數(shù)；k2和k3分別代表ES分解為E+P和E+S的反應速率常數(shù)；k4為E+ P生成ES的反應速率常數(shù)。

首先，脂肪酶（E）與反應底物（S）結(jié)合成反應中間產(chǎn)物（ES），然后反應中間產(chǎn)物分解成產(chǎn)物（P）后，脂肪酶被釋放出來。在反應開始階段，如果產(chǎn)物（P）的濃度較低或沒有產(chǎn)物（P）的反應體系中，可逆反應是不能發(fā)生的，因此k4過程可以忽略，第二步的反應就可以看作是單向反應，即可得出酶解反應的動力學方程：

式中：［S］為底物質(zhì)量濃度，g/mL；［E］total/（g/mL）＝［E］＋［ES］；［ES］為中間產(chǎn)物，g/mL。令km=（k2+k3）/k1，vm=k2［E］total，則方程（3）可簡化為：

方程（4）即為米氏方程，其中km［mg/（g·mL）］為米氏常數(shù)；Vm［mg/（g·mL·min）］為最大反應速率。將米氏方程進行變形，即可得到方程（5）：

1.3.4分析方法

酸值按GB/T 5009.37-2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》測定。

1.3.5數(shù)據(jù)處理方法

每組試驗分別進行3次獨立的重復試驗，用spss19.0 for Windows軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并用Duncan法進行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1酶解時間對椰子油酸值的影響

酶解時間是脂肪酶酶解油脂的主要影響因素。圖1顯示了酶解時間對椰子油酸值影響。

圖1　酶解時間對椰子油酸值的影響Fig.1　Effects of enzymolysis time on acid value

在一定的條件下，脂肪酶能夠結(jié)合在油脂的特定部位水解油脂，隨著酶解時間的增加椰子油不斷被脂肪酶水解，油脂中甘油一酯、甘油二酯和脂肪酸的含量逐漸增加，從而使脂肪酶可利用的底物濃度降低，導致反應速率不斷下降，最終使得反應速率基本保持恒定。從圖1可知，酶解反應60 min最為適宜。

2.2溫度對椰子油水解速率的影響

圖2為溫度對椰子油酶解速率的影響。

圖2　溫度對椰子油水解速率的影響Fig.2　Effect of temperature on hydrolysis rate of coconut oil

由圖2可知，隨溫度不斷升高，椰子油的酸值變化速率逐漸增大，50℃時酸值變化速率最大，50℃以后，反應速率迅速下降。隨著溫度的升高，首先達到酶反應的最適溫度，使得反應速率達到最大；但是當溫度繼續(xù)升高時，脂肪酶會因溫度的升高逐漸失活，從而導致酶促反應速度迅速下降。

2.3酶添加量對椰子油水解速率的影響

圖3為酶添加量對椰子油酶解速率的影響。

由圖3可知，在反應的起始階段，當脂肪酶添加量逐漸增加時，反應速率也隨之增大，反應速率和酶添加量幾乎呈線性關(guān)系變化。在反應體系中如果底物比較充足，隨著酶添加量的增加，反應速率也隨之增大；當酶添加量繼續(xù)增加時，此時反應底物不能滿足酶的需求，反應速率開始減小，并逐漸變慢。本試驗是在底物充足的條件下進行的，因此，酶添加量與酸值的變化速率幾乎呈現(xiàn)線型的規(guī)律變化。

圖3　酶添加量對椰子油水解速率的影響Fig.3　Effect of enzyme concentration on hydrolysis rate of coconut oil

2.4底物質(zhì)量濃度對椰子油酶解速率的影響

圖4為底物質(zhì)量濃度對椰子油酶解速率的影響。

圖4　底物質(zhì)量濃度對椰子油水解速率的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis rate of coconut oil

由圖4可知，當酶添加量一定時，酶解反應速率隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶解速率先增大然后趨于平緩。反應剛開始，反應體系中底物質(zhì)量的濃度較低，水解速率較快，反應速率基本成線性增加；當繼續(xù)增加底物質(zhì)量濃度時，水解速率逐漸變得平緩，這可能是由于酶幾乎全部與底物結(jié)合，此時反應的速率和底物的濃度基本無關(guān)。圖4顯示了［S］與v的關(guān)系，兩者符合典型的雙曲線關(guān)系，符合米氏方程酶促反應特征的，因此可以采用米氏方程對試驗數(shù)據(jù)進行擬合，求得動力學模型。

2.5動力學研究

2.5.1Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法求解方程參數(shù)

圖5Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖Fig.5　Lineweaver-Burk plot

方程的相關(guān)系數(shù)R2＝0.991 2，方程極顯著。

2.5.2Wilkinson法求解酶解方程參數(shù)

Wilkinson統(tǒng)計法是研究動力學的一種方法，一般應用于酶解反應動力學的研究中，研究方法可靠，但是計算過程復雜。它有兩步計算，第一步是最小二乘法求估算解，求得估算值，在估算值的基礎(chǔ)上再利用泰勒展開式求精校解，得出動力學的模型。Wilkinson統(tǒng)計法求估算解見表1，Wilkinson統(tǒng)計法求精校解見表2。

表1為最小二乘法求估算解。由表1可知，△= αε-γδ=0.000 84

式中：Vm0、km0分別為最大反應速率和米氏常數(shù)的估算解。

表2泰勒展開式求精校解。由表2可得到，

式中：a1、a2分別為Vm、km計算修正系數(shù)。

最后可得到精校解為：Vm=Vm0a1=0.969 6［mg/（g· mL·min）］；km=km0+a2/a1=1.273 9［mg/（g·mL）］。

2.5.3Lineweaver-Buck和Wilkinson的比較

對于Lineweaver-Buck法而言，計算過程簡單，用于質(zhì)量濃度在0.33 km～2.0 km反應體系統(tǒng)較為精確；而Wilkinson統(tǒng)計法可用于動力學的分析計算研究中，計算結(jié)果比較精確，但是其分析計算過程比較復雜。因此本試驗又做了Wilkinson統(tǒng)計法校正，求出經(jīng)過精確校正后的Vm=0.969 6［mg/（g·mL·min）］，km= 1.273 9［mg/（g·mL）］。即得脂肪酶水解椰子油的米氏方程：

表1　Wilkinson統(tǒng)計法求估算解Table 1　Calculation of provisional values by Wilkinson method

表2　Wilkinson統(tǒng)計法求精校解Table 2　Fine adjustment of values by Wilkinson method

2.5.4椰子油酶解動力學驗證試驗

取不同質(zhì)量濃度的椰子油反應體系，在酶添加量為1%、酶解溫度50℃條件下進行驗證試驗，對比兩種計算方法可以得到的脂肪酶酶解椰子油的動力學方程的理論值和實測值，然后對方程進行驗證，以確定方程的準確性和可靠性，見圖6。

圖6 酶解動力學驗證試驗Fig.6　Validation of the developed hydrolysis kinetic model

由圖6可知，底物質(zhì)量濃度在0～0.6 g/mL范圍內(nèi)，可采用Lineweaver-Buck法計算反應速率，計算得到的值與實際值比較接近；當?shù)孜镔|(zhì)量濃度大于0.6 g/mL，使用Wilkinson統(tǒng)計法計算得到的計算值與真實值比較接近。而本試驗中的底物質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，Wilkinson統(tǒng)計法可進行方程的求解。而本試驗米氏方程的擬合度較高，因此米氏方程也適合脂肪酶水解椰子油的動力學研究。

3　結(jié)論

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Kinetic Modeling of Enzymatic Hydrolysis of Coconut Oil with Lipase

WU Lin-he，BAI Xin-peng*，WU Qian，XU Xiao-meng，MA Ruo-ying，LI Xue
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

coconut oil；lipase；hydrolysis；enzymatic kinetics

2012-05-09

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31160325）；海南省自然科學基金（20153159）；海南省自然科學基金（314075）；海南省高等學?？蒲许椖浚℉nky2016ZD-1）

武林賀（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

白新鵬（1963—），男，教授，博士。的研究鮮見報道。因此利用脂肪酶水解椰子油來生產(chǎn)其衍生物的研究具有重要意義。本文對脂肪酶水解椰子油的動力學過程進行了研究，考察了底物的質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度和酶解時間等工藝條件對椰子油水解速率的影響，建立動力學模型，以期為今后產(chǎn)業(yè)化開發(fā)椰子油衍生物產(chǎn)品提供理論模型［15］。