董興葉，徐振秋，鄧辰辰，許明君，曹苗苗，高如意（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇連云港222001；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥提取精制新技術(shù)重點研究室，江蘇連云港222001）

擠壓超聲聯(lián)用提取葡萄籽原花青素工藝優(yōu)化

董興葉1,2,3，徐振秋1,2,3，鄧辰辰1,2,3，許明君1,2,3，曹苗苗1,2,3，高如意1,2,3（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇連云港222001；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥提取精制新技術(shù)重點研究室，江蘇連云港222001）

以經(jīng)脫脂后的葡萄籽為原料，擠壓-超聲波聯(lián)用法提取其中原花青素。采用單因素和正交試驗確定最優(yōu)工藝條件。研究結(jié)果表明，擠壓處理最優(yōu)條件：物料含水率10%、擠壓溫度100℃、螺桿轉(zhuǎn)速120 r/min。超聲提取的最優(yōu)條件為：超聲時間15min、超聲波功率80W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度50%、處理溫度45℃。按擠壓-超聲波聯(lián)用最優(yōu)工藝條件提取，原花青素的得率高達(dá)（4.41±0.07）%。

脫脂葡萄籽，原花青素，擠壓-超聲波聯(lián)用法，得率

原花青素是兒茶素等經(jīng)聚合而成的多酚物質(zhì)。原花青素具有抗氧化活性、護(hù)肝解毒作用、抗菌作用及抗癌功能。

原花青素的提取有溶劑法、纖維素酶法和超臨界萃取法等［1-4］。目前，提高得率研究都集中在高效的提取方法上，鮮見研究預(yù)處理對得率的影響。國內(nèi)研究過超微粉碎處理過程及纖維素酶處理過程對其得率的影響［5-6］。但是未見研究擠壓前處理對經(jīng)脫脂后葡萄籽原花青素得率影響的報道。葡萄籽中的功能性成分被纖維素等構(gòu)成的細(xì)胞壁所包圍［5］，其中的原花青素以結(jié)合形式與蛋白質(zhì)和纖維素結(jié)合在一起［6］。擠壓作用時，物料中過熱狀態(tài)的水分子發(fā)生瞬間的氣化蒸發(fā)，巨大的壓力促使其形成多孔狀結(jié)構(gòu)［7-8］。本文以經(jīng)脫脂后葡萄籽粉作為試驗的原料，利用擠壓脫脂葡萄籽粉后采用超聲波提取原花青素，研究最佳的擠壓和提取條件，通過與前期的試驗得出的單純超聲波原花青素提取得率進(jìn)行對比，以期為原花青素工業(yè)化制備和葡萄籽綜合利用提供重要參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄籽：甘肅濱河食品工業(yè)集團(tuán)葡萄酒下腳料，經(jīng)挑選清洗干燥得到；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼斯特公司；無水乙醇、正丁醇、濃鹽酸、石油醚（30℃～60℃）：等均為分析純。

UV-2700型紫外分光光度計：日本導(dǎo)津；DL-120B型超聲波清洗器：上海三信儀器有限公司；DS56-Ⅲ型雙螺桿擠壓膨化機(jī)：濟(jì)南賽信膨化機(jī)械有限公司；R-1005旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；R-LGJ-10D型真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；HC-1000Y微型試樣粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1原花青素得率的測定

1.2.1.1原花青素含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用正丁醇-濃鹽酸法［5］，以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，結(jié)果表明原花青素濃度在上述范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，得出回歸方程為：A=0.4650C－0.0160，R2=0.9999。

樣品的測定：稱取一定量的原花青素提取物，稀釋一定體積后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定在550 nm處的吸光度，由吸光度可知樣品中原花青素含量，再乘以相應(yīng)的體積后即可算出提取得率。

1.2.1.2原花青素得率的計算計算原花青素得率的公式如下：

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的樣品的濃度，mg/mL；V為樣品稀釋體積，mL；M為為經(jīng)脫脂后葡萄籽粉質(zhì)量，g。

1.2.2擠壓膨化處理條件

經(jīng)前期試驗結(jié)果確定的超聲提取原花青素條件：超聲時間15min、超聲波功率80W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度50%、處理溫度45℃。擠壓過程的條件優(yōu)化試驗均在上述條件下進(jìn)行，研究物料含水率、擠壓溫度、螺桿轉(zhuǎn)速對葡萄籽粉中原花青素得率的影響。在螺桿轉(zhuǎn)速為120 r/min、擠壓溫度100℃條件下，物料含水率設(shè)為10%、15%、20%、25%、30%，研究其對原花青素得率的影響；在螺桿轉(zhuǎn)速為120 r/min，含水率為上述優(yōu)化出的結(jié)果，擠壓溫度設(shè)為80、90、100、110、120℃，研究其對原花青素得率的影響；物料含水率、擠壓溫度為上述優(yōu)化出的結(jié)果，螺桿轉(zhuǎn)速設(shè)為80、100、120、140、160 r/min，研究其對原花青素得率的影響。單因素試驗后，通過三因素三水平的正交試驗確定擠壓處理過程最佳工藝參數(shù)。

1.2.3超聲波處理條件

最佳擠壓參數(shù)下處理后的原料進(jìn)行超聲波提取試驗，研究超聲時間、超聲波功率、料液比、乙醇濃度、處理溫度對原花青素得率的影響。在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，超聲波功率80 W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度50%、處理溫度45℃時，研究時間5、10、15、20、25 min對原花青素得率的影響；料液比1：20（g/mL）、乙醇濃度50%、處理溫度45℃，時間為上述優(yōu)化的結(jié)果，研究功率40、50、60、70、80、90W對原花青素得率的影響；乙醇濃度50%、處理溫度45℃，時間、功率為上述優(yōu)化的結(jié)果，研究料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對原花青素得率的影響；乙醇濃度50%，料液比、時間、功率為上述優(yōu)化的結(jié)果，研究溫度25、35、45、55、65℃對原花青素得率的影響；料液比、時間、功率、溫度為上述優(yōu)化的結(jié)果，研究乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%對原花青素得率的影響。單因素試驗后，通過三因素三水平的正交試驗確定超聲提取過程的最佳條件（乙醇濃度和處理溫度采用單因素試驗優(yōu)化出的試驗條件）。

1.2.4原花青素提取物的制備

脫脂葡萄籽粉的制備：清洗、干燥處理后的葡萄籽用粉碎機(jī)粉碎后，過篩，然后用600 mL石油醚浸泡葡萄籽粉200 g，浸泡12 h后再過濾、干燥即得。

擠壓-超聲聯(lián)用法：脫脂葡萄籽粉→擠壓處理→干燥粉碎過篩→超聲提取→提取液減壓濃縮→真空干燥→原花青素提取物。

1.2.5統(tǒng)計分析

所有試驗均平行3次，采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　試驗結(jié)果與分析

2.1擠壓處理條件優(yōu)化

2.1.1物料含水率對得率影響的試驗結(jié)果

物料含水率對得率影響的試驗結(jié)果見圖1。

如圖1所示，物料中含水率增大，原花青素的得率會呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)含水率為10%時，得率達(dá)到最大值。這是因為物料中含水率適當(dāng)時能使其中的纖維充分潤濕膨松，纖維束在受到力的作用時會發(fā)生斷裂和分子重組現(xiàn)象［9］。當(dāng)含水率過低時，膨化機(jī)會發(fā)生堵塞，同時也會引起物料的焦糊。含水量過高，擠出時物料的流動性較大，擠出溫度降低較迅速，改性作用不充分就被擠出，導(dǎo)致得率明顯下降［10］。因此，物料含水率選擇10%為宜。

圖1　物料含水率對原花青素得率的影響Fig.1　Effect of material moisture content on proanthocyanidin yield

2.1.2擠壓溫度對得率影響的試驗結(jié)果

擠壓溫度對得率影響的試驗結(jié)果見圖2。

圖2　擠壓溫度對原花青素得率的影響Fig.2　Effect of extrusion temperaturet on proanthocyanidin yield

由圖2可知，擠出溫度逐漸增加時，原花青素的得率在增加。原因是適當(dāng)?shù)母邷貤l件提高反應(yīng)自由能，改性作用增強(qiáng)，有利于物料形成多孔狀結(jié)構(gòu)［10］。但是，擠壓溫度大于100℃時，得率呈下降的趨勢。這是由于溫度過高物料在機(jī)腔內(nèi)焦糊并結(jié)成硬塊，原花青素得率相應(yīng)的降低［11-12］。因此，擠壓溫度選擇100℃為宜。

2.1.3螺桿轉(zhuǎn)速對得率影響的試驗結(jié)果

螺桿轉(zhuǎn)速對得率影響的試驗結(jié)果見圖3。

圖3　螺桿轉(zhuǎn)速對原花青素得率的影響Fig.3　Effect of screw speed on proanthocyanidin yield

如圖3所示，在擠壓機(jī)螺桿轉(zhuǎn)速增加時，原花青素的得率會增加。這是因為螺桿轉(zhuǎn)速在增加時，物料與螺桿及機(jī)筒之間的摩擦及剪切力增大，顆粒分解作用增強(qiáng)［12］。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過120 r/min時原花青素得率開始下降。這是由于物料在機(jī)筒內(nèi)停留時間短，導(dǎo)致反應(yīng)不徹底。因此，螺桿轉(zhuǎn)速選擇120 r/min為宜。

2.1.4擠壓處理正交試驗

以物料含水率、擠壓溫度、螺桿轉(zhuǎn)速為研究因素，采用正交試驗進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果見表1、表2。

表1 擠壓正交試驗結(jié)果Table 1　Results of orthogonal experiment on ultrasonic extraction

表2方差分析Table 2　Analysis of variance

由極差試驗結(jié)果可知，各因素對原花青素得率影響的順序為擠壓溫度＞物料含水率＞螺桿轉(zhuǎn)速。擠壓原花青素的最優(yōu)方案為A1B2C2，即物料含水率10%，擠壓溫度100℃，螺桿轉(zhuǎn)速120 r/min。方差分析結(jié)果表明：擠壓溫度對擠壓過程具有顯著影響，物料含水率和螺桿轉(zhuǎn)速對對擠壓過程沒有顯著影響。因此，在最優(yōu)方案下進(jìn)行驗證性試驗，得率為（4.39±0.07）%。

2.2超聲處理條件優(yōu)化

2.2.1超聲時間對原花青素得率的影響

超聲時間對原花青素得率的影響結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著超聲提取時間的不斷增加，得率呈現(xiàn)遞增的趨勢。原因是破壞葡萄籽的細(xì)胞壁及原花青素與提取液達(dá)擴(kuò)散平衡均需要一定的時間才能完成［13-14］。但當(dāng)超聲時間超過15 min時，得率出現(xiàn)下降?？赡苁浅曌饔眠^程中，原花青素先析出后被重新吸附導(dǎo)致［15］。因此，超聲時間選擇15 min為宜。

圖4　超聲時間對原花青素得率的影響Fig.4　Effect of the ultrasonic time on proanthocyanidin yield

2.2.2料液比對原花青素得率的影響

料液比對原花青素得率的影響結(jié)果見圖5。

圖5　料液比對原花青素得率的影響Fig.5　Effect of the ratio of liqiud to material on proanthocyanidin yield

由圖5可知，隨著料液比的增加，得率呈現(xiàn)遞增的趨勢。原因是提取時料液比越大，原料中的細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的濃度差就越大，對所要提取的活性成分的浸出十分有利。但料液比超過1∶20（g/mL）時，得率趨于穩(wěn)定。這是由于原料中所要提取的活性成分的基本已全部溶出。如果繼續(xù)增加提取溶劑既增加了成本，又會給濃縮等操作工序帶來不必要的麻煩［16］。因此，料液比選擇1∶20（g/mL）為宜。

2.2.3超聲功率對原花青素得率的影響

超聲功率對原花青素得率的影響結(jié)果見圖6。

圖6　超聲功率對原花青素得率的影響Fig.6　Effect of the ultrasonic power on proanthocyanidins yield

由圖6可知，超聲功率在增加時，得率也在增加。原因是功率大時，提取液與原料接觸次數(shù)相應(yīng)的增多，與此同時空化作用增強(qiáng)能有效地破壞原料的細(xì)胞壁機(jī)構(gòu)，使原花青素得率增加［17-18］。但超聲功率大于80 W時，得率下降。這是由于超聲功率過大時，已經(jīng)空化的氣泡沒有足夠時間爆破，空化作用相應(yīng)的就會減弱，也有可能是大功率時，物理剪切作用使已經(jīng)提取出來的原花青素結(jié)構(gòu)被破壞［19］，得率下降。因此，超聲功率選擇80 W為宜。

2.2.4乙醇濃度對原花青素得率的影響

乙醇濃度對原花青素得率的影響結(jié)果見圖7。

圖7　超聲功率對原花青素得率的影響Fig.7　Effect of ethanol concentration on proanthocyanidin yield

由圖7可知，乙醇濃度在增加時，得率增加。這是由于原花青素屬于多酚類物質(zhì)，分子內(nèi)部存在大量的羥基，使其具有一定的極性，當(dāng)提取劑與原花青素的極性相當(dāng)時［20］，得率最高。原花青素與提取溶劑極性相似度增加，原花青素溶出量增加。但乙醇濃度超過50%時，得率呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于乙醇濃度繼續(xù)增大，使兩者的極性差距變大，原花青素溶解度降低，得率減少［20］。因此，乙醇濃度選擇50%為宜。

2.2.5處理溫度對原花青素得率的影響

處理溫度對原花青素得率的影響結(jié)果見圖8。

圖8　處理溫度對原花青素得率的影響Fig.8　Effect of the extraction temperature on proanthocyanidin yield

由圖8可知，隨處理溫度增加，原花青素的得率呈現(xiàn)增加的趨勢。原因是溫度升高，分子運動程度加大，溶質(zhì)的擴(kuò)散作用增強(qiáng)，有利于原花青素的浸出。但處理溫度超過45℃時，得率下降。這是因為原花青素?zé)岱€(wěn)定性較差，原花青素酚型結(jié)構(gòu)可能遭到破壞。因此，處理溫度選擇45℃為宜。

2.3超聲波對原花青素得率影響的正交試驗

上述最佳擠壓參數(shù)下獲取的原料進(jìn)行超聲波試驗。由單因素試驗結(jié)果可知，乙醇濃度、處理溫度對原花青素的得率影響較小，因此選擇料液比、超聲功率和超聲時間3個對原花青素的得率影響較大的因素進(jìn)行正交試驗（乙醇濃度和處理溫度采用單因素試驗優(yōu)化出的參數(shù)），結(jié)果見表3、表4。

表3 超聲波提取正交試驗結(jié)果Table 3　Results of orthogonal experiment on ultrasonic extraction

表4方差分析Table 4　Analysis of variance

由極差試驗的結(jié)果可以得知，各提取因素對原花青素得率影響的順序為料液比＞功率＞時間。最優(yōu)方案為A2B2C2，即超聲功率80 W，超聲時間15 min，料液比1∶20（g/mL）。方差分析結(jié)果表明：液料比對提取原花青素具有顯著的影響，超聲時間和超聲功率對提取原花青素沒有顯著的影響。在正交試驗中得到的理論最佳組合條件下測定原花青素得率，并做3組平行。得出擠壓-超聲波聯(lián)用法得率高達(dá)（4.41±0.07）%。

3　結(jié)論

擠壓處理最優(yōu)條件為：物料含水率10%、擠壓溫度100℃、螺桿轉(zhuǎn)速120 r/min。超聲提取的最優(yōu)條件為：超聲時間15min、超聲波功率80W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度50%、處理溫度45℃。擠壓-超聲波聯(lián)用法原花青素得率高達(dá)（4.41±0.07）%。經(jīng)本實驗室前期試驗得出超聲波法原花青素的得率僅為（3.18±0.06）%（試驗條件：超聲時間20 min、超聲波功率80 W、料液比1∶25（g/mL）、乙醇濃度50%、處理溫度45℃）。因此，與單純的超聲提取法相比，擠壓-超聲波聯(lián)用法可以大幅度提高原花青素得率。

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Optimization of Extraction Technology of Proanthocyanidins from Grape Seeds by Extrusion in Conjunction with Ultrasound

DONG Xing-ye1，2，3，XU Zhen-qiu1，2，3，DENG Chen-chen1，2，3，XU Ming-jun1，2，3，CAO Miao-miao1，2，3，GAO Ru-yi1，2，3（1.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，Jiangsu，China；2.Jiangsu Kanion
Parmaceutical Co.，Ltd.，State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Lianyungang 222001，Jiangsu，China；3.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.，Ltd.，The Key Laboratory for the New
Technique Research of TCM Extraction and Purification，Lianyungang 222001，Jiangsu，China）

Extrusion in conjunction with ultrasonic treatment was used to extract proanthocyanidins from defatted grape seeds.The optimal extraction conditions by single factor test and orthogonal test were obtained.The results showed that the optimal extraction conditions of extrusion treatment were as following：material moisture content 10%，extrusion temperature 100℃and screw speed 120 r/min.The optimal extraction conditions of ultrasonic treatment were as following：the ultrasonic time 15 min，the ultrasonic power 80 W，the ratio of material to liquid 1∶20（g/mL），ethanol concentration 50%，the temperature 45℃.Under this condition，proanthocyanidins yield could reach up to（4.41±0.07）%.

defatted grape seeds；proanthocyanidins；extrusion in conjunction with ultrasonic treatment；yield

2015-09-18

重大新藥創(chuàng)制（2013ZX09402203）

董興葉（1988—），女（漢），工程師，碩士研究生，從事保健食品研發(fā)工作。