霍勝楠，孟靜，楊振東，鄭世超，張然（.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南500；.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫4）

3種食源性致病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)

霍勝楠1，孟靜1，楊振東2，鄭世超1，張然1
（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

DNA提取方法采用先鋼珠機(jī)械破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，再添加丙酮、蛋白酶K溶解去除雜質(zhì)，大大提高了食源性致病菌基因組DNA的得率和純度。繼而針對(duì)金黃色葡萄球菌egc基因、沙門氏菌NA（not availabale）基因、志賀氏菌ipaH基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)特異性引物對(duì)樣品建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)3種細(xì)菌具有很強(qiáng)特異性，除目標(biāo)細(xì)菌外，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌3種對(duì)照菌均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到10-6、10-6、10-7ng/μL。

食源性致病菌；基因組DNA提??；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

食源性致病菌主要引起食源性疾病，對(duì)人類健康造成極大的傷害，是食品安全的重大隱患。已報(bào)道的食源性致病菌已經(jīng)超過250種［1］，沙門氏菌［2］、金黃色葡萄球菌［3］、志賀氏菌［4］等都是肆虐流行的重要食源性致病菌。食源性致病菌的檢測(cè)技術(shù)是食源性疾病與控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前包括中國在內(nèi)的許多國家對(duì)這些致病菌的檢驗(yàn)大多仍沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)及生化鑒定方法，其檢驗(yàn)周期長、操作繁瑣、靈敏度低，很難適應(yīng)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)的需要［5］。實(shí)時(shí)定量熒光PCR能克服以上缺點(diǎn)，檢測(cè)在一個(gè)密閉環(huán)境中進(jìn)行，無污染和后處理風(fēng)險(xiǎn)，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)核酸，達(dá)到定量檢測(cè)食品中致病菌的目的［6］。

另外，在食品樣品檢測(cè)中，經(jīng)常會(huì)遇到致病菌含量低、食品基質(zhì)復(fù)雜等問題，而以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)核酸提取的要求既要純度高又要回收率高，目前單純的商品試劑盒提取很難滿足這種要求［7］。核酸提取的關(guān)鍵在于組織細(xì)胞的裂解和核酸純化，本文采用鋼珠破碎結(jié)合生化試劑溶解細(xì)胞壁方式增加細(xì)菌細(xì)胞裂解，大大提高了核酸的提取效率，減少了由于細(xì)胞破碎不徹底帶來的檢測(cè)失誤，是實(shí)際樣品DNA提取操作的必然之選。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

細(xì)菌增殖培養(yǎng)液LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂（NA）：購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白酶K：購自寶生物工程（大連）有限公司；丙酮、無水乙醇等試劑均為分析純：購自上海國藥公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：購自德國Qiagen公司。

1.1.2菌種選擇及生化鑒定

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC-21493）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）：均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。將試驗(yàn)菌株在NA瓊脂上進(jìn)行分離培養(yǎng)，根據(jù)GB 4789系列食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)活化菌株進(jìn)行鏡檢及相應(yīng)生理生化鑒定。挑取陽性單菌落接種至LB肉湯中培養(yǎng)過夜備用。

1.2主要儀器

NanoDrop 2000紫外可見分光光度計(jì)：美國Thermo公司；7500 FAST實(shí)時(shí)熒光PCR儀：美國ABI公司；5424R小型冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；核酸提取用鋼珠：美國BIOSPEC公司產(chǎn)品。

1.3基因組DNA提取方法

細(xì)菌總DNA提取方法參照Qiagen公司細(xì)菌核酸提取試劑盒。但在金黃色葡萄球菌細(xì)胞破碎時(shí)分別采用蛋白酶K酶解、丙酮溶解、丙酮/酶解、鋼珠/丙酮/酶解、丙酮/鋼珠/酶解方法。

1.4擴(kuò)增引物探針的設(shè)計(jì)與合成

選取金黃色葡萄球菌egc基因、沙門氏菌NA（not availabale）基因、志賀氏菌ipaH基因作為選擇特異性基因，首先在Genbank中獲得上述3種基因的基因序列，然后利用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。各檢測(cè)基因的引物、探針序列如表1所示。均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物、探針Table 1　Specific primers and probes sequences in RT-PCR

1.5實(shí)時(shí)熒光PCR方法分析

PCR反應(yīng)體系為25 μL，各組分分別為：2×TaKaRa TaqTMBuffer 12.5 μL，引物 Primer-F和Primer-R（10 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，DNA模板1 μL，加蒸餾水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95°C變性10 s，95°C退火5 s，60°C延伸40 s，經(jīng)40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用ABI 7500FAST Software v2.0.1進(jìn)行分析處理。判定CT值小于35的擴(kuò)增結(jié)果為致病菌檢測(cè)陽性結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)菌株的生理生化確認(rèn)

試驗(yàn)菌株在NA上進(jìn)行分離培養(yǎng)，接種至顯色培養(yǎng)基，利用GB 4789系列食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行鏡檢及相應(yīng)生理生化鑒定。通過與鑒定表比對(duì)，試驗(yàn)菌株均符合相應(yīng)均屬特征，可作為驗(yàn)證試驗(yàn)用菌株。

2.2細(xì)菌基因組DNA的提取及純度檢測(cè)

在金黃色葡萄球菌基因組DNA提取過程中，單純酶解或丙酮處理對(duì)于DNA的濃度和純度無顯著影響（表2）。當(dāng)結(jié)合鋼珠破碎細(xì)胞壁步驟后，核酸的得率顯著提高，約為單純丙酮酶解得率的2.5倍。而鋼珠破碎步驟與酶解和丙酮處理步驟的先后順序?qū)怂岬寐薀o顯著影響。本試驗(yàn)在細(xì)胞破壁釋放DNA步驟中，先鋼珠機(jī)械破壁，再添加丙酮溶脂、蛋白酶K處理的方法具有較高的DNA提取效率，所得DNA濃度大于100 ng/μL，A260/A280值在1.8～2.0之間，DNA純度高，且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠以及有效防止由于鋼珠告訴振動(dòng)可能造成的有機(jī)溶劑泄露，可以滿足下一步實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性要求。

2.3實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系的引物特異性驗(yàn)證

針對(duì)3種選定菌株，選用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌作為對(duì)照菌株，分別用3種引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，見圖1。結(jié)果顯示，目標(biāo)菌株均在35個(gè)循環(huán)內(nèi)發(fā)生顯著擴(kuò)增，而對(duì)照菌株均無顯著性檢測(cè)信號(hào)，亦沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增信號(hào)，表明設(shè)計(jì)的3對(duì)引物特異性好，識(shí)別度高，無干擾現(xiàn)象。

2.4實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系的靈敏度分析

以無菌操作將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌基因組DNA做模板，按10倍遞增逐級(jí)稀釋，自100 ng/μL濃度稀釋至10-7ng/μL分別做靈敏度測(cè)試。PCR結(jié)果如圖2所示。3種致病菌基因組DNA濃度從100 ng/μL到10-7ng/μL使用本文所建立的PCR方法均可在40個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)顯著擴(kuò)增。一般認(rèn)為當(dāng)Ct值小于35時(shí)可判斷PCR結(jié)果為陽性。當(dāng)細(xì)菌DNA模板濃度稀釋至10-6ng/μL時(shí)，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)仍可為陽性；當(dāng)細(xì)菌DNA模板濃度稀釋至10-5ng/μL，沙門氏菌和志賀氏菌的檢測(cè)仍然為陽性。

表2　不同核酸釋放步驟在金黃色葡萄球菌基因組DNA提取效果比較Table 2　Comparison of different nucleic acid release steps in Staphylococcus aureus genomic DNA extraction effect

圖1實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果圖Fig.1　Real-time fluorescence quantitative specificity curve of 3 pathogens

圖23種細(xì)菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度擴(kuò)增曲線（常態(tài)型）Fig.2　Real-time fluorescence quantitative amplification detection limit curve of 3 pathogens（Normal view）

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及線性檢測(cè)范圍

以10倍梯度稀釋細(xì)菌DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)。試驗(yàn)得出的常態(tài)型擴(kuò)增曲線（圖2）顯示：總體上所有曲線的拐點(diǎn)清楚，指數(shù)增長期明顯，基線平穩(wěn)無上揚(yáng)現(xiàn)象，低濃度樣本擴(kuò)增曲線指數(shù)明顯，一方面說明靈敏度高，另一方面不易出現(xiàn)假陽性、假陰性的誤判；曲線指數(shù)期斜率大，表明擴(kuò)增效率高，實(shí)際靈敏度、引物和探針效果好；擴(kuò)增曲線的整體平行性好，相鄰濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線與曲線之間的間距都十分接近，是擴(kuò)增效率都搞的反應(yīng)。且圖2中，基線起峰范圍適當(dāng)，各檢測(cè)結(jié)果都在12～35之間，保證了定量的準(zhǔn)確性。

以DNA模板濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)建立本研究RT-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的檢測(cè)線性范圍可以達(dá)到8個(gè)數(shù)量級(jí)，志賀氏菌的檢測(cè)線性范圍可以達(dá)到9個(gè)數(shù)量級(jí)。CT值和起始模板濃度的相關(guān)性好，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性可以達(dá)到0.999以上，而志賀氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性略差，也達(dá)到0.99以上，3種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線均接近理想值。

圖3　3種細(xì)菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Real-time fluorescence quantitative standard curve of 3 pathogens

3　討論

高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行基因檢測(cè)和研究的前提。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測(cè)方面的廣泛應(yīng)用，世界各大實(shí)驗(yàn)室都積極致力于更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用效率更高的DNA提取方法。Ramos-Gomez［8］等利用CATB方法提取橄欖油、葵花籽油等多種蔬菜油產(chǎn)品中的DNA，其提取產(chǎn)物純度和數(shù)量都可滿足后續(xù)q-PCR檢測(cè)的需要。為檢測(cè)生豬肉中的沙門氏菌，Lofstrom等研究利用核酸吸附柱提取商品肉中的細(xì)菌核酸，并比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法與非PCR方法，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR比非PCR方法靈敏度更高特異性更強(qiáng)［9］。Sowmya［10］等利用1%的表面活性劑Triton X-100去除食品樣品中的雜質(zhì)，有效提取牛奶、甘蔗汁和米飯中的金黃色葡萄球菌基因組DNA。但此方法僅適用于選定樣品的加標(biāo)樣核酸提取，其他樣品推廣仍待考究。研究發(fā)現(xiàn)，普通細(xì)菌基因組DNA提取方法針對(duì)腸桿菌科的革蘭氏陰性桿菌都有較高的提取效率，但對(duì)含芽孢的細(xì)菌及金黃色葡球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等革蘭氏陽性菌的提取效率較低。其主要原因在于革蘭氏陽性球菌細(xì)胞壁較厚，傳統(tǒng)的DNA釋放方法熱裂解法、酶解法、SDS法、酚/氯仿提取法不能高效的溶解破壞細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致DNA量少雜質(zhì)多。為了尋求一種高效的細(xì)菌基因組DNA提取方法，提取高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA，獲得更準(zhǔn)確的PCR結(jié)果，綜合各種研究方法的利弊，本研究建立的改良細(xì)菌基因組DNA提取方法，在細(xì)菌破壁、DNA釋放步驟中，通過加入丙酮處理，破壞細(xì)胞壁脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)合鋼珠振蕩處理機(jī)械力與蛋白酶K消化，增強(qiáng)了細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)了DNA的釋放。本方法適用于革蘭氏陰性細(xì)菌及革蘭氏陽性細(xì)菌基因組DNA的高效提取，較傳統(tǒng)核酸提取方法，所提取的基因組DNA濃度、純度高，可以滿足RT-PCR和PCR-RELP對(duì)DNA模板高質(zhì)量的要求。

按照我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)要求，加工食品中，肉制品、乳制品、飲料等金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌是必檢項(xiàng)目，不得檢出，上述3種致病菌的快速檢測(cè)方法開發(fā)也成為食品安全檢測(cè)中的研究熱點(diǎn)。本研究選擇金黃色葡萄球菌egc、沙門氏菌NA（not available）、志賀氏菌ipaH基因，設(shè)計(jì)試時(shí)熒光PCR方法特異引物和TaqMan探針。經(jīng)NCBI序列比對(duì)，用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌特異序列均與同屬內(nèi)病原菌有較高的相似性（＞93%）。Goto［11］等利用特異性引物采用RT-PCR方法當(dāng)牛奶樣品中金黃色葡萄球菌DNA濃度達(dá)到50 ng～50 pg即可準(zhǔn)確的檢出金黃色葡萄球菌。另一篇報(bào)道中Chiang等采用熱激蛋白htrA設(shè)計(jì)新型特異性引物，可以檢測(cè)到牛奶和肉中最低1 CFU/mL的金黃色葡萄球菌［12］。同樣采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，有研究顯示可在多種食品中檢出多種沙門氏菌，最低檢測(cè)限可達(dá)到0.2 CFU/ mL～2.0 CFU/mL［2］。對(duì)于志賀氏菌的檢測(cè)通常都與金黃色葡萄球菌和沙門氏菌同時(shí)進(jìn)行。有報(bào)道顯示利用RT-PCR方法，對(duì)樣品采取先細(xì)菌增生再檢測(cè)的處理，可以檢測(cè)最低1 CFU/10 g濃度的志賀氏菌，并且這種檢測(cè)與普通的生化檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異［13］。同其他PCR檢查方法相比，本試驗(yàn)的靈敏度更低，檢測(cè)準(zhǔn)確性更高。本研究為食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌的快速鑒定探索了有效的檢測(cè)方法。

4　結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)范圍寬、靈敏度高，初始細(xì)菌DNA模板的濃度可以低至10-5和10-6數(shù)量級(jí)，是一種穩(wěn)定性、精確度、特異性好的檢測(cè)方法。該方法可準(zhǔn)確應(yīng)用于各種材料食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的檢測(cè)，為控制食源性致病菌污染提供有效手段。

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Rapid Detection Using Real Time-PCR for Three Foodborne Pathogens

HUO Sheng-nan1，MENG Jing1，YANG Zhen-dong2，ZHENG Shi-chao1，ZHANG Ran1
（1.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，Shandong，China；2.The School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The genome DNA of Staphylococcus aureus was extracted by four different method and finally chose a method combined steel ball destruction and acetone，protease K removing impurities to get high purity and output DNA.Then the protein gene（egc）of Staphylococcus aureus，a NA gene of Salmonella，and ipaH gene （iapH）of Shigella were used as the gene targets.And the samples were determined by real-time PCR technique.The results showed that the primers were highly specific.No fluorescence signal was determined in other 3 control pathogens（Listeria monocytogenes，Vibrio parahaemolyticus and Bacillus cereus）but target bacteria. The RT-PCR assay could be specific and rapid，and the detection limits were 10-6，10-6，10-7ng/μL.

foodborne pathogens；DNA extraction；real-time polymerase chain reaction

2016-05-06

霍勝楠（1980—），女（漢），高級(jí)工程師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锇踩L(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及技術(shù)開發(fā)。