孫　艷，張　華，封青川，范玉佳，李　濤，張玉超，賀　穎，鄭　紅#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細胞生物學(xué)系 鄭州 450001　2)河南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 鄭州 450003　3)鄭州市婦幼保健院優(yōu)生科 鄭州 450012

?

Spink8基因?qū)C9706細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響*

孫艷1，2)，張華3)，封青川1)，范玉佳1)，李濤1)，張玉超1)，賀穎1)，鄭紅1)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細胞生物學(xué)系 鄭州 4500012)河南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 鄭州 4500033)鄭州市婦幼保健院優(yōu)生科 鄭州 450012

Spink8基因；食管癌細胞；增殖；凋亡；細胞遷移

目的：探討Spink8基因?qū)θ耸彻馨〦C9706細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響。方法：利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建Spink8真核表達重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染EC9706細胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞。取未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞，采用RT-PCR和Western blot 法檢測Spink8 mRNA和蛋白，MTT法檢測細胞增殖，Annexin V-APC/7-AAD法檢測細胞凋亡，并進行Transwell細胞遷移實驗。結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細胞比較，穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞增殖受到抑制(P<0.05)，增殖抑制率為24.5%；細胞凋亡率增加(P<0.05)； Transwell小室穿膜細胞數(shù)減少(P<0.05)。結(jié)論：Spink8可能是一個新的抑癌基因。

食管癌是上消化道中最具有侵略性的惡性腫瘤之一，但其確切的發(fā)病機制仍未闡明。Li等[1]運用全基因組陣列分析技術(shù)并借助生物信息學(xué)篩選可能對食管癌具有重要致病作用的基因和通路，研究結(jié)果提示絲氨酸蛋白酶Kazal型抑制劑8(serine protease inhibitor kazal type 8，Spink8)在食管癌組織中表達下調(diào)，提示Spink8可能是一個新的抑癌基因，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。作者對Spink8基因?qū)θ耸彻馨〦C9706細胞的增殖、凋亡及遷移能力的影響進行了探討。

1　材料與方法

1.1主要試劑EC9706由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室惠贈，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，ReverAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒購于美國Thermo公司，原核表達載體pGEX-5X-3、真核表達載體pEGFP-C1、限制性核酸內(nèi)切酶(BamHⅠ和EcoRⅠ)、T4連接酶購于TaKaRa公司，Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購于Axygen公司。PCR擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，兔抗人Spink8多克隆抗體、內(nèi)參GAPDH單克隆抗體及HRP標記的二抗購自Abcam公司。

1.2穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞系的建立

1.2.1原核表達載體的構(gòu)建Trizol法提取健康人外周血總RNA，按第一鏈 cDNA 合成試劑盒所述步驟以隨機引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)GenBank中收錄的人類Spink8基因cDNA序列設(shè)計引物，并在上下游引物中分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(F1: 5’-CGCGGATCCCAATGAAGGGGATCTGCT CA-3’；F2:5’-CCGGAATTCTACGTTCAAGAGTTTTCA CATT-3’)。以獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增，將原核表達載體pGEX-5X-3及Spink8的PCR產(chǎn)物分別于37 ℃用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶4 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，陽性克隆(pGEX-Spink8)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，觀察GST-Spink8融合蛋白的表達情況，以驗證所調(diào)取的基因能否正常表達。

1.2.2真核表達載體的構(gòu)建以pGEX-Spink8為模板，PCR擴增Spink8編碼框。合成5’端含EcoRⅠ(上游)和BamHⅠ(下游)酶切位點的引物(P1: 5’-CCGGAATTCCACCATGAAGGGGATCTGCTCA-3’;P2:5’-CGCGGATCCCGTTCAAGAGTTTTCACATT-3’)。再將真核表達載體pEGFP-C1和Spink8的PCR產(chǎn)物分別于37 ℃用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶4 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，陽性克隆(pEGFP-Spink8)經(jīng)雙酶切和測序驗證。

1.2.3細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染EC9706細胞在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%已滅活的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中。收獲對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，待細胞密度達到80%～90%時，參照Sofast轉(zhuǎn)染試劑盒操作指南轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-Spink8，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞。

1.4細胞增殖抑制率檢測按8 000個/孔將3組細胞分別接種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μL 5 g/L的MTT，避光孵育4 h，棄掉孔內(nèi)液體，加入DMSO 150 μL平搖5 min，酶標儀測量490 nm波長處各孔的吸光度(A)。細胞增殖抑制率=[(1-實驗組A值)/對照組A值]×100%。以未轉(zhuǎn)染細胞為對照組。

1.5細胞凋亡檢測根據(jù)Annexin V-APC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒操作說明處理細胞，上流式細胞儀檢測凋亡率。

1.6細胞遷移實驗分別收集3組細胞并用不含血清和雙抗的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為4×104mL-1，在Transwell小室的下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，上室加入200 μL細胞液，常規(guī)培養(yǎng)20 h后棄去下室內(nèi)培養(yǎng)基，無水乙醇固定10 min，1 g/L結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下計數(shù)小室上室底膜下室面的細胞數(shù),即穿膜細胞數(shù)。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，3組各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1穩(wěn)定表達Spink8細胞系的鑒定EC9706細胞內(nèi)源性Spink8蛋白低表達，轉(zhuǎn)染pEGFP-Spink8質(zhì)粒后可以檢測到Spink8 mRNA及蛋白的表達量增加,見圖1、2，提示成功建立了穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞系。

2.23組細胞增殖抑制率的比較3組細胞增殖實驗A值比較見表1。穩(wěn)定表達Spink8細胞組A值較未轉(zhuǎn)染細胞組明顯降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與穩(wěn)定表達Spink8細胞組增殖抑制率分別為9.8%和24.5%。

2.33組細胞凋亡率的比較見表1?？梢姺€(wěn)定表達Spink8細胞組凋亡率明顯高于其他兩組(P<0.05)。

M:Marker；1、4：未轉(zhuǎn)染組；2、5：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組；3、6：穩(wěn)定表達Spink8細胞組；1～3：Spink8；4～6：GAPDH。圖1　3組Spink8 mRNA相對表達情況

1：未轉(zhuǎn)染組；2：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組；3：穩(wěn)定表達Spink8細胞組。圖2　3組Western blot 結(jié)果

2.43組細胞遷移能力的比較見圖3、表1。穩(wěn)定表達Spink8細胞組穿膜細胞數(shù)明顯低于未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P<0.05)，而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A:未轉(zhuǎn)染組；B:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組;C:穩(wěn)定表達Spink8細胞組。圖3　3組Transwell 細胞遷移情況(×200)

表1　3組各指標的比較

*：與未轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05；#：與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較，P<0.05。

3　討論

Spink是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族最大的一個分支[2]，包含多個亞族，該家族的特征是都含有Kazal結(jié)構(gòu)域。典型的Kazal結(jié)構(gòu)域包含2個α螺旋、3個反向平行β折疊和3對二硫鍵[3]。Spink8基因定位于3p21.3，基因全長27.958 kb，包含5個外顯子，編碼97個氨基酸。

該研究中，作者首先克隆Spink8基因，通過原核表達來檢測所調(diào)取的基因能否正常表達。IPTG誘導(dǎo)表達獲得的GST融合蛋白大小約37 000，已知GST標簽蛋白大小為26 000，推測Spink8蛋白相對分子質(zhì)量大小約11 000，這與用ExPASy軟件預(yù)測Spink8蛋白大小一致，表明作者所克隆的Spink8基因可以正常表達，避免了由于基因本身的問題導(dǎo)致后續(xù)實驗假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

原核表達驗證之后構(gòu)建真核表達載體pEGFP-Spink8，轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞， 使食管癌細胞Spink8基因過表達，構(gòu)建穩(wěn)定表達Spink8的EC9706細胞。結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達Spink8細胞增殖抑制率較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染組細胞明顯升高，細胞凋亡率增加，說明提高EC9706細胞內(nèi)Spink8基因的表達量對細胞增殖具有一定抑制作用，Spink8對EC9706細胞增殖的抑制率為24.5%。目前臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物有5-氟尿嘧啶、紫杉醇、順鉑及阿霉素，它們對細胞的抑制率分別為55.62%、74.44%、77.71%、94.67%[4]。與這些抗腫瘤藥物相比，Spink8對細胞的增殖抑制作用較弱。

Spink家族的諸多成員在人體生理功能、機體炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[5-6],其中Spink7已被確定為抑癌基因，其能夠通過uPA/纖溶酶活性來抑制腫瘤細胞的遷移及侵襲[7-8]。該研究結(jié)果顯示，Spink8也能夠降低EC9706細胞的遷移能力。此外，Cheng等[9]還發(fā)現(xiàn)Spink7參與了中心體的復(fù)制以維持染色體的穩(wěn)定,避免因染色體異常而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，該過程依賴于P53通路。單一基因的改變往往不足以影響細胞的凋亡，常常需有多個基因的協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)細胞凋亡。因此，對于Spink8的作用機制還應(yīng)該與其他腫瘤相關(guān)基因一起研究。

總之，作者從細胞水平探究了Spink8對EC9706細胞的作用，Spink8過表達可以在一定程度上抑制食管癌EC9706細胞的增殖及遷移，并促進其凋亡，可能是一個新的抑癌基因。但是，該研究還停留在細胞水平，尚需進行蛋白表達層面及相關(guān)分子機制的研究，以為腫瘤的預(yù)防、早期診斷和預(yù)后判斷提供理論基礎(chǔ)和新的途徑。

[1]LI JD，F(xiàn)ENG QC,LI JS.Differential gene expression profiling of oesophageal squamous cell carcinoma by DNA microarray and bioinformatics analysis[J].J Int Med Res,2010,38(6):1904

[2]OU CM,TANG JB,HUANG MS,et al.The mode of reproductive-derived Spink(serine protease inhibitor Kazal-type) action in the modulation of mammalian sperm activity[J].Int J Androl,2012,35(1):52

[3]WAPENAAR MC,MONSUUR AJ,POELL J,et al.The SPINK gene family and celiac disease susceptibility[J].Immunogenetics,2007,59(5):349

[4]黃銀久,宋寶安,金林紅,等.MTT比色法抗腫瘤藥物篩選實驗條件和數(shù)據(jù)優(yōu)化探索[J].激光生物學(xué)報,2009,18(3):401

[5]J?ERGENSEN MT,BRUSGAARD K,NOVOVIC S,et al.Is the SPINK1 variant p.N34S overrepresented in patients with acute pancreatitis? [J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2012,24(3):309

[6]ROCKETT JC,PATRIZIO P,SCHMID JE,et al.Gene expression patterns associated with infertility in humans and rodent models[J].Mutat Res,2004,549(1/2):225

[7]CHENG X,LU SH,CUI Y. ECRG2 regulates ECM degradation and uPAR/FPRL1 pathway contributing cell invasion/migration[J]. Cancer Lett,2010,290(1): 87

[8]TANG CH,WEI Y.The urokinase receptor and integrins in cancer progression[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(12):1916

[9]CHENG X,SHEN Z,YANG J,et al.ECRG2 disruption leads to centrosome amplification and spindle checkpoint defects contributing chromosome instability[J].J Biol Chem,2008,283(9):5888

(2015-11-05收稿責(zé)任編輯王曼)

Effects of Spink8 gene on proliferation,apoptosis and migration of EC9706 cells

SUNYan1，2),ZHANGHua3),FENGQingchuan1),FANYujia1),LITao1),ZHANGYuchao1),HEYing1),ZHENGHong1)

1)DepartmentofMedicalGeneticsandCellBiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofReproductiveMedicine,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500033)PrepotencyDivision,WomenandInfantsHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450012

Spink8 gene；esophageal cancer cell；proliferation；apoptosis；cell migration

Aim: To investigate the effects of Spink8 gene on proliferation, apoptosis and migration of human esophageal cancer cell EC9706. Methods: Eukaryotic expression plasmid pEGFP-Spink8 was established by DNA recombination in vitro, and transfected into EC9706 cells. The expressions of Spink8 mRNA and protein were examined by RT-PCR and Western blot. MTT method was used to detect cell proliferation, Annexin V-APC/7-AAD method was used to detect cell apoptosis, and migration ability was detected by Transwell assay. Results: The plasmid of pEGFP-Spink8 was successfully established. Compared with the EC9706 cells without transfection or transfected with null plasmid, the number of surviving cells transfected with pEGFP-Spink8 decreased(P<0.05), and proliferation inhibition rate was 24.5%; the apoptosis rate was significantly increased(P<0.05); the number of cells which passed Transwell chamber decreased(P<0.05). Conclusion: Spink8 may be a new tumor suppressor gene.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.003

，女，1966年3月生，博士，教授，研究方向：遺傳性疾病的致病基因的篩選與研究，E-mail:hzheng@zzu.edu.cn

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃201303001

R735.1