弓園芳，施夢(mèng)麗，張　勤，崔　凱，陳淅泠#

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 鄭州 450014　2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 鄭州 450014

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血管性癡呆患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性和血漿Hcy水平檢測(cè)*

弓園芳1)，施夢(mèng)麗2)，張勤1)，崔凱1)，陳淅泠1)#

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 鄭州 4500142)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 鄭州 450014

血管性癡呆；基因多態(tài)性；同型半胱氨酸；葉酸；維生素B12

目的：探討血管性癡呆(VaD)與MTHFR基因多態(tài)性和血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平的關(guān)系。方法：選取73例VaD患者和75例非癡呆腦梗死患者，使用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)評(píng)定VaD患者癡呆嚴(yán)重程度。應(yīng)用PCR-芯片雜交法測(cè)定其MTHFR基因多態(tài)性，酶循環(huán)法測(cè)定血漿Hcy水平，免疫分析法測(cè)定葉酸、維生素B12水平。結(jié)果：VaD組MTHFR基因TT基因型及T等位基因頻率高于非癡呆腦梗死組(P<0.05)，MTHFR基因TT、CT型血漿Hcy水平高于CC型(P<0.001)；VaD組血漿Hcy水平顯著高于非癡呆腦梗死組(P<0.001)，癡呆程度與血漿Hcy水平呈正相關(guān)(r=0.227，P=0.018);非癡呆腦梗死組葉酸、維生素B12水平高于VaD組(P<0.05)。結(jié)論：MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變及高Hcy血癥可能和VaD的發(fā)生相關(guān)。

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是繼阿爾茨海默病后最為常見(jiàn)的一種癡呆類型，報(bào)道[1]稱70歲以上人群的患病率高達(dá)1.5%。腦梗死、出血、低血流灌注及低氧耗腦損害等為VaD的主要病因，另外各種腦血管危險(xiǎn)因素在該病的發(fā)病機(jī)制中也起關(guān)鍵作用[2]。血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)升高是誘發(fā)VaD的一個(gè)獨(dú)立的高危因素。N5,N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy的限速酶，其C677T位突變可引起高Hcy血癥。作者對(duì)VaD與血漿Hcy及MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變的關(guān)系進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科2013年9月至2015年5月住院的73例VaD患者，其中男40例，女33例，年齡65～90(76.8±7.1)歲；同期住院的75例非癡呆腦梗死患者75例，男45例，女30例，年齡62～87(76.5±6.9)歲。兩組年齡、性別、教育程度、吸煙、飲酒等狀況均衡，具有可比性。VaD及非癡呆腦梗死患者均符合1995年全國(guó)第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的各類腦血管病診斷要點(diǎn)，且腦卒中時(shí)間長(zhǎng)于3個(gè)月。VaD組患者的選取還應(yīng)符合NINDS/AIREN的“很可能癡呆”診斷標(biāo)準(zhǔn)和DSM-IV的癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，MMSE評(píng)分≤24分、HIS評(píng)分≥7分和CDR評(píng)分≥1分的患者。排除其他癡呆類型，如AD、LBD、PD等，排除各種嚴(yán)重心肺疾病、心源性腦栓塞、嚴(yán)重感染、肝腎功能異常、惡性腫瘤等疾病。

1.2癡呆嚴(yán)重程度評(píng)估 根據(jù)簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(mini-mental state examination，MMSE)評(píng)分將VaD組患者分為輕度、中度、重度3組。輕度癡呆組(20分≤MMSE評(píng)分<25分)30例，中度癡呆組(10分≤MMSE評(píng)分<20分)28例，重度癡呆組(MMSE評(píng)分<10分)15例。

1.3血清Hcy、維生素B12和葉酸檢測(cè) Hcy檢測(cè)采用日立7600-020全自動(dòng)生化分析儀及Hcy測(cè)定試劑盒(上海德賽診斷系統(tǒng)公司)，應(yīng)用酶循環(huán)法測(cè)定Hcy濃度，≥15 μmol/L可診斷為高Hcy血癥[4]。 血清維生素B12和葉酸檢測(cè)采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特Uniceldxi800免疫分析儀及試劑盒(上海百傲科技有限公司)，應(yīng)用免疫分析法測(cè)定。

1.4MTHFR基因檢測(cè)采用PCR-芯片雜交法。抽取研究對(duì)象空腹肘前靜脈血1 mL，提取血液基因組DNA。應(yīng)用MTHFR基因檢測(cè)試劑盒(上海百傲科技有限公司)進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 5 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s;56 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Bai O雜交顯色試劑盒(上海百傲科技有限公司)反應(yīng)B液10 μL與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻成雜交液備用。已標(biāo)記的MTHFR基因芯片放入全自動(dòng)雜交儀片架中，加入190 μL雜交緩沖液和10 μL雜交液反應(yīng)。應(yīng)用Bai O基因芯片圖像分析軟件和MTHFR基因型分析軟件分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)兩組基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。兩組間葉酸、維生素B12、Hcy水平比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組不同癡呆程度患者Hcy水平比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，VaD組血漿Hcy水平與癡呆程度的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1MTHFR基因多態(tài)性 通過(guò)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，得到樣品DNA與MTHFR(C677T)基因位點(diǎn)的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像，軟件分析后，判斷其基因型為CC(野生型)、CT(雜合突變型)和TT(純合子突變型)(圖1)。

A：CC基因型；B：TT基因型；C：CT基因型。圖1　MTHFR基因型檢測(cè)結(jié)果

2.2VaD組與非癡呆腦梗死組MTHFR基因型及等位基因頻率分布VaD組和非癡呆腦梗死組基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=1.600和0.724，P=0.581和0.230)，具有群體代表性。2

組MTHFR基因型及等位基因頻率分布比較見(jiàn)表1，VaD組MTHFR基因純合子突變(TT)和雜合子突變(CT)發(fā)生率明顯高于非癡呆腦梗死組，VaD組T等位基因頻率也高于非癡呆腦梗死組。

表1　VaD組與非癡呆腦梗死組MTHFR基因型及等位基因頻率分布　例(%)

2.2VaD組與非癡呆腦梗死組血漿Hcy、葉酸和維生素B12水平見(jiàn)表2。VaD組血漿Hcy水平明顯高于非癡呆腦梗死組，葉酸水平明顯低于非癡呆腦梗死組，而維生素B12水平低于非癡呆腦梗死組。

表2　VaD組與非癡呆腦梗死組血漿Hcy、葉酸和維生素B12水平比較

2.3VaD組癡呆程度與血漿Hcy水平的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知隨著Hcy水平升高，MMSE分值下降，癡呆程度加重。與輕度癡呆組比較，中度及重度癡呆組患者血漿Hcy水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與中度癡呆組比較，重度癡呆組患者血漿Hcy水平也升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)相關(guān)性分析VaD組患者血漿Hcy水平與癡呆程度呈正相關(guān)(r=0.227，P=0.018)。

表3　VaD組癡呆程度與血漿Hcy水平的關(guān)系

*：與輕度癡呆組比較，P<0.05；#：與中度癡呆組比較，P<0.05。

2.4MTHFR不同基因型對(duì)血漿Hcy水平的影響

見(jiàn)表4，兩組MTHFR基因TT型血漿Hcy濃度顯著高于CT及CC型；兩組CT型血漿Hcy濃度與CC型相比亦有顯著性差異；兩組不同基因型Hcy濃度比較為TT>CT>CC。

表4　MTHFR不同基因型血漿Hcy水平的比較

*：與同組CC型比較，P<0.001。

3　討論

VaD是一種慢性進(jìn)行性疾病，隨著年齡的增加其患病率逐漸上升。Hcy是一種含巰基的氨基酸，是蛋氨酸循環(huán)脫甲基后的衍生物，參與體內(nèi)的多種甲基化反應(yīng)。研究[5]顯示Hcy可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血小板產(chǎn)生血栓素，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖, 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。有研究[4]報(bào)道，血清Hcy每升高5 μmol/L，腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加59%；每降低3%，腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)則降低24%。另有研究[6]結(jié)果顯示，輕度的Hcy 濃度升高與VaD和阿爾茨海默病均具有相關(guān)性，而VaD患者的血漿Hcy水平升高較AD 患者更為常見(jiàn)。該研究結(jié)果顯示VaD組血漿Hcy水平顯著高于非癡呆腦梗死組，提示血漿Hcy水平升高是誘發(fā)VaD的一個(gè)獨(dú)立的高危因素。

血漿Hcy水平不僅受環(huán)境因素影響，與遺傳也有關(guān)[7]，研究較多的是其與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系。MTHFR是血漿Hcy代謝的限速酶，其活性降低可以導(dǎo)致Hcy在血液中堆積。人類位于染色體1p36.3的MTHFR基因整個(gè)編碼區(qū)長(zhǎng)1 980 bp，編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為746 000，其氨基酸序列高度保守。MTHFR的基因型有多種，當(dāng)編碼該酶的基因在第677位發(fā)生錯(cuò)義突變時(shí)，由堿基T置換堿基C，產(chǎn)生TT基因型，使MTHFR酶活性下降，影響葉酸代謝，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，與VaD的發(fā)病有關(guān)[8-10]。徐小紅等[11]通過(guò)meta分析合并14個(gè)試驗(yàn)，結(jié)果示MTHFR基因C677T多態(tài)性的T等位基因可增加患VaD的風(fēng)險(xiǎn)。該研究結(jié)果顯示，VaD組TT基因型及T等位基因頻率明顯高于非癡呆腦梗死組，兩組MTHFR基因CT型和TT型血漿Hcy水平顯著高于CC型，表明MTHFR基因C677T等位基因的突變可能是高Hcy血癥發(fā)生的遺傳因素之一，與國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究[9-10]相一致。

意大利一項(xiàng)針對(duì)健康老年人血漿Hcy 水平與認(rèn)知的研究[12]發(fā)現(xiàn)，隨著血漿Hcy 水平的逐漸升高，MMSE 評(píng)分逐漸降低。Hooshmand等[13]通過(guò)對(duì)274例非癡呆老年患者Hcy、葉酸、鈷胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(維生素B12的生物活性片段) 及認(rèn)知功能的7 a隨訪發(fā)現(xiàn)，Hcy、葉酸、鈷胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與認(rèn)知功能相關(guān)。該研究結(jié)果顯示，VaD組血漿Hcy水平顯著高于非癡呆腦梗死組，葉酸、維生素B12水平的檢出率顯著低于非癡呆腦梗死組，且VaD組血漿Hcy水平與癡呆嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，表明高Hcy血癥是老年認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素。有研究[14]表明補(bǔ)充葉酸以降低Hcy濃度，可預(yù)防與年齡相關(guān)的認(rèn)知能功能下降。

總之，MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變及Hcy酸血癥可能和VaD的發(fā)生相關(guān)。該研究屬于回顧性分析，未能對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行補(bǔ)充葉酸、維生素B12的干預(yù)且樣本量小、評(píng)價(jià)手段局限，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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(2015-11-18收稿責(zé)任編輯李沛寰)

Detection of MTHFR gene polymorphism and plasma homocysteine levels in patients with vascular dementia

GONGYuanfang1)，SHIMengli2)，ZHANGQin1)，CUIKai1)，CHENXiling1)

1)DepartmentofGeriatrics，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500142)DepartmentofNuclearMedicine，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

vascular dementia;gene polymorphism;homocysteine;folate;Vitamin B12

Aim: To investigate the association between MTHFR gene polymorphism and plasma homocysteine(Hcy)levels in patients with vascular dementia(VaD).Methods: A total of 73 patients with VaD and 75 patients with nondemented cerebral infarction were recruited in the study. PCR-RFLP was used to analyze the polymorphism of MTHFR gene. The folic acid and vitamin B12 levels were measured using immunoassay method. And circulating enzymatic method was empolyed to test the Hcy concentration in plasma. The degree of dementia was classified according to the MMSE for patients with VaD.Results: The genotype TT and T allele frequency of MTHFR gene in VaD group were significantly higher than that in nondementia cerebral infarction group(P<0.05). The concentration of plasma Hcy was higher in patients with TT and CT type than those with CC genotype(P<0.001). Mean total plasma Hcy concentration was significantly higher in VaD patients than that in the patients with nondemented cerebral infarction(P<0.001), but the levels of folate and vitamin B12 were significantly lower in VaD patients than in the patients with nondemented cerebral infarction(P<0.05). The degree of dementia was positively related with plasma Hcy level(r=0.227，P=0.018).Conclusion: Genetic mutations of MTHFR C677T and the hyperhomocysteinemia may closely related to the occurrence of VaD.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.023

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目201403095

，女，1964年4月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：老年癡呆，E-mail：13938289530@126.com

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