李　燕,李思雪,王立軒,劉　敏,王亞萍,馬慧娟

1)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科 石家莊 050017　2)河北醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)七年制臨床醫(yī)學(xué)班 石家莊 050017　3)河北醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 石家莊 050017　4)河北醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室 石家莊 050017　5)河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050017

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慢性間歇性低壓低氧對(duì)大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響*

李燕1),李思雪2),王立軒3),劉敏4),王亞萍4),馬慧娟4，5)#

1)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科 石家莊 0500172)河北醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)七年制臨床醫(yī)學(xué)班 石家莊 0500173)河北醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 石家莊 0500174)河北醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室 石家莊 0500175)河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050017

慢性間歇性低壓低氧；血管舒張；eNOS；PI3K；大鼠

目的：探討慢性間歇性低壓低氧(CIHH)對(duì)大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響及其機(jī)制。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CIHH組、對(duì)照+阻斷劑組和CIHH+阻斷劑組。CIHH大鼠給予每天6 h模擬海拔5 000 m的低壓低氧處理，對(duì)照置于常壓常氧環(huán)境同期飼養(yǎng)，28 d后處死大鼠，制備肺動(dòng)脈環(huán)，加阻斷劑組給予終濃度為10 μmol/L MEK特異性阻斷劑PD98059或PI3K阻斷劑LY294002處理20 min。采用灌流實(shí)驗(yàn)記錄乙酰膽堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈的舒張活動(dòng);應(yīng)用Western blot法檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中eNOS的表達(dá)水平。結(jié)果：CIHH處理可增強(qiáng)乙酰膽堿引起的肺動(dòng)脈舒張，提高肺動(dòng)脈組織中eNOS的表達(dá)(P<0.05)；PD98059共孵育對(duì)CIHH的作用無(wú)影響(P>0.05),LY294002共孵育可部分阻斷CIHH的作用(P<0.05)。結(jié)論：CIHH處理可能通過(guò)PI3K途徑活化血管內(nèi)皮eNOS，增強(qiáng)乙酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈舒張。

近年大量研究[1-2]顯示，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia, CIHH)對(duì)機(jī)體具有多種有益作用，如：對(duì)抗心臟缺血/再灌注損傷、抗心律失常、改善冠心病患者的血脂異常等；并且可以產(chǎn)生神經(jīng)、肝臟保護(hù)作用。CIHH具有對(duì)機(jī)體不利影響小、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、安全等優(yōu)點(diǎn)，已被臨床用作非藥物性輔助治療措施[3]。肺動(dòng)脈在維持肺循環(huán)和正常心臟功能中起著至關(guān)重要的作用。肺動(dòng)脈高壓可以引起肺血管阻力增加，出現(xiàn)肺水腫和右心室肥厚，最終引起右心衰竭[4]。有研究[5]報(bào)道，CIHH具有抗高血壓作用，可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的動(dòng)脈血壓。研究[6-7]還證實(shí)CIHH對(duì)大鼠的基礎(chǔ)動(dòng)脈血壓無(wú)影響，但可以對(duì)抗病理性動(dòng)脈血壓變化，并能異化壓力感受性反射。血管平滑肌的舒縮活動(dòng)在動(dòng)脈血壓的形成和維持中發(fā)揮重要作用。一氧化氮(nitric oxide，NO)是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)皮衍生舒張因子，是心血管系統(tǒng)重要的生理性調(diào)節(jié)因子。該研究通過(guò)離體血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)，觀察CIHH 對(duì)大鼠肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響，并探討其可能的NO相關(guān)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、PI3K阻斷劑LY294002、MEK特異性阻斷劑PD98059均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PE和ACh溶于水。LY294002、PD98059溶于DMSO。eNOS抗體、PI3K抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性SD大鼠，體重250～320 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組、CIHH組、對(duì)照+阻斷劑組和CIHH+阻斷劑組,每組12只。CIHH大鼠置于低壓氧艙，給予模擬海拔5 000 m高原(大氣壓為53.732 kPa，氧分壓為11.172 kPa)的低壓低氧處理，每天6 h，其余時(shí)間處于常氧環(huán)境。未行CIHH處理的大鼠置于常壓常氧環(huán)境同期飼養(yǎng)。動(dòng)物自由攝取食物和水。28 d后大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，迅速開肺，取肺動(dòng)脈，置于盛有冰K-H 液的培養(yǎng)皿內(nèi)，去除血管周圍組織，將肺動(dòng)脈剪成長(zhǎng)3～4 mm的動(dòng)脈環(huán)備用。K-H液成分(mmol/L)：NaCl 118.0、KCl 4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、NaHCO325.0、KH2PO41.2、葡萄糖11.0，pH 7.4。將直徑約0.1 mm的不銹鋼三角形環(huán)鉤小心穿入上述制備的肺動(dòng)脈環(huán)，置于盛有5 mL K-H液的恒溫(37 ℃)浴槽內(nèi)，持續(xù)通入體積分?jǐn)?shù)95% O2和5%CO2的混合氣體。動(dòng)脈環(huán)通過(guò)不銹鋼絲和細(xì)線與張力換能器連接，用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)記錄張力，平衡20 min后，調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)張力至5.8×10-3N后，加阻斷劑組給予終濃度為10 μmol/L PD98059[8]或LY294002[9]處理20 min，然后進(jìn)行1.3中實(shí)驗(yàn)。

1.3ACh誘導(dǎo)的離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的測(cè)定上述各組大鼠肺動(dòng)脈環(huán)預(yù)先給予10-6mol/L PE誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮，后以累加給藥法給予ACh(10-9～10-5mol/L)，記錄血管舒張曲線。以舒張幅度占最大收縮幅度的百分比表示血管舒張狀態(tài)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析觀察CIHH和阻斷劑處理對(duì)大鼠肺動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1CIHH和PD98059處理對(duì)離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響結(jié)果見圖1，由圖1可知，CIHH可增強(qiáng)ACh引起的肺動(dòng)脈舒張，PD98059不影響各組大鼠肺動(dòng)脈的舒張效應(yīng)。

2.2CIHH和PD98059處理對(duì)肺動(dòng)脈組織中eNOS蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖2、表1。

2.3CIHH和LY294002處理對(duì)離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，CIHH可增強(qiáng)ACh引起的肺動(dòng)脈舒張，LY294002孵育可以阻斷CIHH對(duì)肺動(dòng)脈的舒張效應(yīng)。

圖1　CIHH和PD98059處理對(duì)離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響

1：對(duì)照組；2：CIHH組；3：對(duì)照+阻斷劑組；4：CIHH+阻斷劑組。圖2　CIHH和PD98059處理對(duì)肺動(dòng)脈組織中eNOS蛋白表達(dá)的影響

表1　CIHH和PD98059處理對(duì)肺動(dòng)脈組織中eNOS蛋白表達(dá)的影響(n=6)

FCIHH=85.056，P<0.001；FPD98059<0.001，P>0.999；F交互=0.549，P=0.467。

圖3　CIHH和LY294002處理對(duì)離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響

2.4CIHH和LY294002處理對(duì)肺動(dòng)脈組織中eNOS表達(dá)的影響見圖4、表2。

1：對(duì)照組；2：CIHH組；3：對(duì)照+阻斷劑組；4：CIHH+阻斷劑組。圖4　CIHH和LY294002處理對(duì)肺動(dòng)脈組織中eNOS表達(dá)的影響

表2　CIHH和LY294002處理對(duì)肺動(dòng)脈組織中eNOS表達(dá)的影響(n=6)

FCIHH=94.388，P<0.001；FLY294002=23.538，P<0.001；F交互=8.140，P<0.001。

3　討論

CIHH對(duì)人體的有益作用逐漸引起關(guān)注，而其抗高血壓作用也越來(lái)越引起人們的重視[5]。該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIHH組大鼠肺動(dòng)脈舒張功能增強(qiáng)，證明CIHH可以增強(qiáng)ACh誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈的舒張功能。

NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種內(nèi)皮衍生舒張因子,是心血管系統(tǒng)重要的生理性調(diào)節(jié)因子。NO可以激活血管平滑肌細(xì)胞的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致胞內(nèi)cGMP水平升高，再通過(guò)經(jīng)典的cGMP途徑使蛋白激酶活化，進(jìn)而引發(fā)血管舒張[10]，降低血管張力。有研究[11]表明，eNOS可降低肺動(dòng)脈高壓，延緩肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展和肺血管的重塑。該研究結(jié)果證實(shí)CIHH處理后，大鼠肺動(dòng)脈中eNOS的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示CIHH可以通過(guò)激活eNOS，提高局部組織中NO的水平，增強(qiáng)肺血管的舒張功能。

組織中存在不同的分子途徑可以活化eNOS，如：MEK途徑、PI3K途徑、cAMP/PKA途徑等[12]。為了進(jìn)一步明確CIHH激活eNOS的分子機(jī)制，作者應(yīng)用MEK特異性阻斷劑PD98059孵育肺動(dòng)脈，結(jié)果顯示PD98059不影響CIHH的作用，提示CIHH激活的eNOS可能不依賴MEK途徑。

PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，作為一種重要的信號(hào)酶，可以通過(guò)酪氨酸激酶受體途徑和G-蛋白偶聯(lián)受體途徑活化Akt[13]。研究[14]顯示內(nèi)皮細(xì)胞中的Akt能夠促進(jìn)eNOS的磷酸化并增加 NO的含量，提高 NO 的活性及增加 eNOS mRNA 的穩(wěn)定性。該研究結(jié)果顯示，CIHH處理后，大鼠肺動(dòng)脈eNOS蛋白的表達(dá)增加；PI3K特異性阻斷劑LY294002孵育可以阻斷CIHH的舒血管效應(yīng)，并明顯抑制CIHH大鼠肺動(dòng)脈組織中eNOS的表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)了CIHH處理可通過(guò)PI3K途徑增強(qiáng)大鼠肺動(dòng)脈eNOS的表達(dá)，提高組織中NO水平，進(jìn)而引起肺動(dòng)脈舒張。

綜上所述，該研究證實(shí)CIHH可顯著增強(qiáng)ACh誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈舒張效應(yīng)，該作用可能與PI3K途徑激活、增加肺動(dòng)脈中eNOS的表達(dá)，進(jìn)而提高血管中NO的水平有關(guān)。

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(2015-11-02收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of chronic intermittent hypobaric hypoxia on pulmonary vasodilatation of rats

LIYan1),LISixue2),WANGLixuan3),LIUMin4),WANGYaping4),MAHuijuan4,5)

1)DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500172)ClassofSeven-YearClinicalMedicineRegisteredin2011，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500173)DepartmentofHistologyandEmbryology，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500174)DepartmentofPhysiology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500175)HebeiKeyLaboratoryofExperimentalAnimal,Shijiazhuang050017

chronic intermittent hypobaric hypoxia;vasodilatation;eNOS;PI3K;rat

Aim: To investigate the effects of chronic intermittent hypobaric hypoxia(CIHH)on the vasodilatation of isolated pulmonary artery in rats and the underlying mechanism. Methods: Adult male SD rats were randomly allocated into 4 groups: control group, CIHH group, control+blocking agent group and CIHH+blocking agent group. The rats in CIHH groups were exposed to hypoxia simulating 5000 m high altitude in a hypobaric chamber for 28 d, 6 h each day. The rats in control group were maintained in a normoxic environment for a corresponding period. The rats in groups treated with blocking agent were given 10 μmol/L MEK inhibitor PD98059 or PI3K inhibitor LY294002 for 20 min.The vasodilatation of pulmonary artery was recorded by using organ bath technique. The protein expression level of eNOS in pulmonary artery tissue was measured by Western blot. Results: CIHH could remarkably augment the acetylcholine(ACh) induced vasodilatation of pulmonary artery and increase the expression of eNOS in pulmonary artery tissue(P<0.05). Incubated with PD98059 did not affect the effects of CIHH on pulmonary artery. Incubation of LY294002 blocked the effects of CIHH(P<0.05). Conclusion: The data demonstrate that CIHH treatment may enhance ACh induced vasodilatation of pulmonary artery by activating eNOS via PI3K pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.008

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助31100832；河北省自然科學(xué)基金資助C2013206183，C2013206174；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)資助項(xiàng)目201310089004

，女，1973年11月生，博士，副教授，研究方向：心血管生理學(xué)，E-mail:ankang006@126.com

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