左松林，　李欣宇，　伍明剛，　張　昭，　王景濤，　朱金玲

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SCN9A基因rs10930210位點(diǎn)多態(tài)性與癲癇發(fā)生的相關(guān)性

左松林1，李欣宇1，伍明剛1，張昭1，王景濤2，朱金玲3

目的探討SCN9A基因多態(tài)性與癲癇發(fā)生的相關(guān)性。 方法搜集134例癲癇患者及正常對(duì)照組73例血樣，提取全基因組DNA。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)、測(cè)序法檢測(cè)rs10930210位點(diǎn)多態(tài)性，比較該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的差異。結(jié)果SCN9A基因rs10930210位點(diǎn)多態(tài)性在癲癇組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論SCN9A基因rs10930210位點(diǎn)多態(tài)性與癲癇易感性無(wú)關(guān)。

癲癇；SCN9A；單核苷酸多態(tài)性；遺傳易感性

癲癇是一種以身體痙攣為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由于神經(jīng)皮質(zhì)細(xì)胞的異常放電而導(dǎo)致的陣發(fā)性行為。近年來(lái)對(duì)癲癇家系進(jìn)行的一系列相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，癲癇具有家族遺傳性。另外，大量與癲癇相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明，60%的癲癇患者在兒童期發(fā)病。目前，眾多研究表明癲癇與電壓門(mén)控鈉離子通道(voltage -gated sodium channels，VGSCs)的功能改變有密切聯(lián)系[1]。哺乳類(lèi)動(dòng)物腦細(xì)胞的VGSCs由一個(gè)α亞單位與一個(gè)或更多的輔助β亞單位組成的復(fù)合體所構(gòu)成。負(fù)責(zé)編碼人的電壓門(mén)控性鈉離子通道α亞單位的基因是SCN1A-SCN11A?，F(xiàn)有的研究已表明，基因突變很容易導(dǎo)致離子通道結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致通道功能異常，從而使動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)發(fā)生紊亂、大腦神經(jīng)元異常放電而導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。

近年來(lái)，鈉離子通道編碼基因某些位點(diǎn)的單核苷酸基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是否與癲癇的發(fā)病及臨床療效相關(guān)，引起人們的關(guān)注，為此我們選擇SCN9A基因的TapSNPs研究其與癲癇發(fā)生的相關(guān)性，為癲癇的診斷、治療與預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1　研究對(duì)象

研究對(duì)象為癲癇患者134例，正常對(duì)照組73例。患者均由佳木斯市中心醫(yī)院鑒定。收集對(duì)照組和患者晨起靜脈血3.0 ml。正常對(duì)照組的年齡和居住區(qū)域和患者組相匹配。

2　研究方法

2.1SNP位點(diǎn)的選擇NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(kù)檢索SCN9A基因，得到該基因的染色體位置為Chromosome 2,NC_000002.12 (166195185..166375987, complement)。進(jìn)入HapMap網(wǎng)站，選擇中文模式，HapMap 數(shù)據(jù)下選擇通用基因組瀏覽器，標(biāo)志或區(qū)域填寫(xiě)Chr2:166,195,185..166,375,987，數(shù)據(jù)來(lái)源，保存、查詢及其它選擇SNP genotype data，配置CHB，下載并保存dumped_region.hmp。運(yùn)行Haploview，自動(dòng)選擇TagSNPs。根據(jù)有無(wú)合適酶切位點(diǎn)，選擇本課題TagSNPs。最終選取SCN9A的TagSNP為rs10930210。

2.2SNP位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中查得rs10930210SNP位點(diǎn)的序列，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)其用Oligo6.0軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，正向引物序列為F:ACAGGGATGATACAGGCACAC；反向引物序列為R:GCCAATCATTCCTCAACCAGC。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為469 bp，引物由上海生工合成。

2.3基因組DNA提取用基因組DNA提取試劑盒提取DNA (BioTeKe全血基因組提取試劑盒)，DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為15 μl，包括2×Power Taq PCR Master Mix 8 μl，正反向引物各1 μl，模板DNA 1 μl，加ddH2O至15 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃終末延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小及特異性。

2.5限制性酶切酶切PCR產(chǎn)物。Rs10930210位點(diǎn)的內(nèi)切酶為SspI。酶切反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物5 μl，10×buffer 1 μl，SspI酶為0.5 μl，最后加8.5 μl的ddH20，總體積為15 μl。酶切反應(yīng)體系配好振蕩混勻后，放置于37 ℃水浴箱中酶切5 min。65 ℃，8 min，終止酶切。

2.6瓊脂糖凝膠電泳及分型15 μl酶切產(chǎn)物電泳分型：2%瓊脂糖，電壓150 V，電泳30 min，紫外線凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行基因分型。

2.7DNA測(cè)序選取該位點(diǎn)3種不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程股份有限公司完成測(cè)序。

2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分別計(jì)算基因型頻率和基因頻率并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P>0.05驗(yàn)證該群體為平衡群體。運(yùn)用Microsoft Excel 2013統(tǒng)計(jì)癲癇組與對(duì)照組基因型頻率和基因頻率，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)　果

3.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

3.2SNP位點(diǎn)測(cè)序圖及凝膠電泳圖。

3.2.1rs10930210位點(diǎn)基因分型相應(yīng)測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)圖1)。

3.2.2rs10930210位點(diǎn)基因分型相應(yīng)凝膠電泳圖(見(jiàn)圖2)。

3.3癲癇組與對(duì)照組的SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布情況(見(jiàn)表2)。癲癇組與對(duì)照組的rs10930210位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布不存在顯著差異。SCN9A基因位點(diǎn)rs10930210在癲癇病例組和對(duì)照組間基因型頻率采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果P>0.05，兩者之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病例組和對(duì)照組之間的等位基因頻率采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果P>0.05，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1　病例組與對(duì)照組等位基因的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

注：自由度λ=2，癲癇組和對(duì)照組的觀察數(shù)與預(yù)期數(shù)之間比較P>0.05

表2　癲癇組與對(duì)照組的rs10930210位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布比較

注：癲癇組的基因型頻率與基因頻率與對(duì)照組之間比較P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖1a為野生型純合子AA；b為突變雜合子AT；c為突變純合子TT

圖2M為DNA Marker，1為原樣本(不做酶切的PCR產(chǎn)物)；2為突變純合子TT(酶切產(chǎn)物)；3、4為野生型純合子AA(酶切產(chǎn)物)；5、6為突變雜合子AT(酶切產(chǎn)物)

4　討　論

癲癇是一類(lèi)常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患，是由于大腦神經(jīng)元異常同步放電引起的大腦功能障礙，其具有發(fā)作性、突然性、短暫性以及重復(fù)性等特征[2]。癲癇發(fā)生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)是大腦神經(jīng)元細(xì)胞膜電生理興奮性增高，易于形成癲癇性放電。遺傳因素在癲癇發(fā)生機(jī)制中起到了很重要的作用。據(jù)唐章龍[2]等學(xué)者的資料顯示，他們按照 Falconer 方法，對(duì)89個(gè)癲癇高發(fā)家系的進(jìn)行臨床遺傳學(xué)分析、計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性癲癇一級(jí)親屬的遺傳度為66.98%，介于60%～70%，證明了遺傳因素在癲癇的發(fā)病中具有明顯的作用。這一結(jié)論和其他大量癲癇相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)、群體遺傳學(xué)研究結(jié)論相符，均表明遺傳因素在癲癇發(fā)病機(jī)制中不可忽視的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，40%的癲癇為遺傳因素引起的癲癇。

近年來(lái)，電壓門(mén)控通道的基因突變與癲癇發(fā)生的關(guān)系引起了研究學(xué)者們的關(guān)注，包括電壓門(mén)控鉀、鈣、氯、鈉離子通道和γ-氨基丁酸受體(GABA)和乙酰膽堿受體[3,4]。電壓門(mén)控鈉離子通道(VGSCs)主要負(fù)責(zé)控制細(xì)胞興奮性，其結(jié)構(gòu)和功能異?？梢鸺?xì)胞膜興奮性改變，在癲癇發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。電壓門(mén)控鈉離子通道由α和β亞基構(gòu)成，α亞基由同一家族的基因負(fù)責(zé)編碼，包括SCN1A～SCN11A，分別編碼不同的亞型：Nav1.1～Nav1.9。其中，SCN9A基因負(fù)責(zé)編碼Nav1.7[5]。SCN9A基因在機(jī)體中對(duì)鈉離子進(jìn)入細(xì)胞以及神經(jīng)元之間的交流起導(dǎo)向作用。當(dāng)SCN9A基因發(fā)生突變后，將導(dǎo)致大腦中鈉離子通道功能發(fā)生改變，并阻礙神經(jīng)元之間的聯(lián)系。

Nav編碼基因中某些單核苷酸基因多態(tài)性不同的等位基因及基因型與癲癇易感性具有相關(guān)性[5]。SCN9A基因是第五個(gè)被發(fā)現(xiàn)能引起熱性驚厥的基因[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，SCN9A基因不僅分布在外周神經(jīng)，在中樞神經(jīng)也有表達(dá)，且隨著年齡增長(zhǎng)，在海馬的表達(dá)持續(xù)增加。2009年,Singh等學(xué)者在對(duì)定位于2q24 的全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)家系進(jìn)行突變分析中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SCN9A的突變：I62V 和 P149Q。在對(duì)嬰兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇(SMEI) 家系進(jìn)行SCN9A 突變分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，數(shù)個(gè)患者同時(shí)攜帶SCN9A和SCN1A的突變[8,9]。但迄今為止，SCN9A導(dǎo)致癲癇的機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此我們選擇SCN9A的rs10930210作為篩查位點(diǎn)，以探討SCN9A基因的SNPs與癲癇發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果顯示，癲癇組與對(duì)照組間rs10930210的等位基因分布差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果提示我們，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義角度考慮，SCN9A基因rs10930210不適合作為癲癇易感性的潛在遺傳標(biāo)記物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rs10930210位點(diǎn)多態(tài)與癲癇發(fā)生無(wú)相關(guān)性。原因可能是：(1)不同地區(qū)、不同民族、不同人群、不同年齡的SNPS發(fā)生率存在差異;(2)本研究的研究個(gè)數(shù)偏少;(3)SCN9A的SNP位點(diǎn)眾多。我們將進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本個(gè)數(shù)，對(duì)SCN9A的多個(gè)SNP位點(diǎn)與癲癇發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行連鎖分析，探討SCN9A基因多態(tài)性與癲癇發(fā)生的相關(guān)性，為臨床上提示癲癇易感性、提早預(yù)防以及病情的控制和治療提供理論依據(jù)。

[1]張麗敏,康熙雄,丁成赟.鈉離子通道基因多態(tài)性在癲癇中的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2012,6(22):7324-7326.

[2]唐章龍.89個(gè)癲癇高發(fā)家系的臨床遺傳學(xué)分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2010,8:1208-1211.

[3]周陽(yáng).癲癇的遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,50(3):406-410.

[4]宋延民.電壓門(mén)控鈉離子通道與癲癇[J].中華中華臨床醫(yī)師雜志,2011,5(11):3262-3264.

[5]吳江紅,任栓成,楊秀明,等.電壓門(mén)控鈉離子通道與癲癇[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2013,33(3):240-245.

[6]Yang Y,Wang Y,Li S,et al.Mutations in SCN9A,encoding a sodium channel alpha subunit,in patientswith primary erythermalgia[J].J Med Genet,2004,41(3):171-174.

[7]Miriam H,Meisler M,Janelle E,et al.Sodium channel gene family:epilepsy mutations,gene interactions and modifier effects[J].Physiol,2010,588(11):1841-1848.

[8]Mechaly I,Scamps F,Chabbert C,et al.Molecular diversity of voltagegated sodium channel alpha subunits expressed in neuronal and nonneuronal excitable cells[J].Neuroscience,2005,130(2):389-396.

[9]Singh NA,Pappas C,Dahle EJ,et al.A role of SCN9A in human epilepsies，as a cause of febrile seizures and as a potential modifier of Dravet syndrome[J].PLoS Genet,2009,5:e1000649.

Explore the relationship between SCN9A gene polymorphism and epilepsy

ZOUSonglin,LIXinyu,WUMinggang,etal.

(BasicMedicineDepartmentofJiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

ObjectiveExplore the relationship between SCN9A gene polymorphism and epilepsy.MethodsCollected peripheral blood on 73 cases of normal control and 134 cases of epilepsy patients,and extracted genomic DNA by kits.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP),sequencing detected rs10930210 polymorphism,comparing the genotypes and allele frequency differences.ResultsSCN9A gene rs10930210 polymorphism loci no significant differences between the epilepsy group and control group (P>0.05).Conclusionrs10930210 polymorphism of SCN9A gene were not associated with epilepsy.

Epilepsy;SCN9A;Single nucleotide polymorphisms

1003-2754(2016)08-0708-03

2016-04-12；

2016-08-02

2015年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃指導(dǎo)項(xiàng)目資助(No.201510222043)；佳木斯大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助(No.CXTDPY-201602)

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)科技處，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

朱金玲，E-mail：370786436@qq.com

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