王毓國　竇永起　秦麗

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黛黃芍藥散對放射性直腸炎大鼠COX-2、TXB2及6-Keto-PGF1α的影響

王毓國竇永起秦麗

目的通過動物實驗，研究中藥復(fù)方黛黃芍藥散在抑制微血管血栓形成、改善腸道微循環(huán)方面對放射性直腸炎的作用機制。方法選用雌性Wistar大鼠60只，隨機分為6組：空白對照組、模型組、地塞米松組及黛黃芍藥散高、中、低劑量組，用60Co-γ射線單次盆腔照射制作大鼠放射性直腸炎模型，各組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，在照射后第14天給藥12小時后處死大鼠，取直腸進行免疫組化檢測其環(huán)氧化酶2 (cyclooxygenase-2，COX-2)的表達，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組血清中血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)、6-酮-前列腺素(6-keto-prostaglandin F1α，6-Keto-PGF1α)的濃度，并計算TXB2/6-Keto-PGF1α比值。結(jié)果照射后第14天，模型組大鼠COX-2、TXB2含量及TXB2/6-Keto-PGF1α比值明顯升高，而黛黃芍藥散各劑量組中上述指標明顯低于模型組(P<0.01)。結(jié)論黛黃芍藥散可有效抑制放射性直腸炎大鼠腸道微血管血栓生成，改善微循環(huán)，其作用機制可能是通過控制COX-2的表達，從而減少TXB2的合成與釋放，進而調(diào)節(jié)TXB2/6-Keto-PGF1α比值。

黛黃芍藥散；放射性直腸炎；環(huán)氧化酶2；血栓素B2；6-酮-前列腺素F1α

研究表明[1]，血小板增多及功能亢進易導(dǎo)致腸炎加重，其原因有兩方面：一為血小板的激活、聚集促進微血管血栓形成，阻塞血管，導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙，加重腸黏膜缺血缺氧，引起進一步損傷；另一方面血小板功能亢進導(dǎo)致更多炎癥因子的釋放，加速炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[2-3]。其中環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2) 及6-酮-前列腺素(6-keto-prostaglandin F1α，6-Keto-PGF1α)在血小板聚集、活化，血栓形成并加重炎癥反應(yīng)等整個炎癥反應(yīng)過程中具有重要作用。COX-2是將花生四烯酸催化合成TXB2和6-Keto-PGF1α的關(guān)鍵限速酶，能使炎癥不斷放大[4]。TXB2與6-Keto-PGF1α兩者之間的動態(tài)平衡是調(diào)控血管壁緊張度、血小板功能及血管壁細胞遷移生長、止血及防止血栓形成和調(diào)節(jié)局部血流的重要因素。

課題組通過前期動物實驗，證明了黛黃芍藥散可減少核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及相關(guān)炎性信號因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(interleckin-6，IL-6)的表達，進而減輕炎癥反應(yīng)，本文以炎癥反應(yīng)的重要影響因素——微血管血栓形成為著眼點，探討黛黃芍藥散在抑制微血管血栓形成、改善微循環(huán)方面，對放射性直腸炎的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

實驗動物為清潔級Wistar大鼠60只，雌性，體質(zhì)量180～220 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK-(軍)2012-0004，動物飼養(yǎng)于光、暗各12小時,恒溫、恒濕的安靜飼養(yǎng)室內(nèi)。1.2藥物及給藥方法

黛黃芍藥散組方：青黛10 g、黃連10 g、黃柏10 g、牡丹皮15 g、赤芍20 g，血竭膠囊3 g，均購自中國人民解放軍總醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定后，煎煮2次，經(jīng)過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮，按成人臨床等效劑量(體表面積法折算)的1、2、4倍，分別配置成含中藥0.68 g/mL、1.36 g/mL、2.72 g/mL的藥液，4℃冰箱避光密封保存。取雌性Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為：空白對照組、模型組、地塞米松組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組10只。各組均于照射后次日開始灌胃，每天1次，連續(xù)14天?？瞻讓φ战M、模型組均給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，地塞米松組給予地塞米松溶液1.2 mg/kg灌胃，中藥低、中、高劑量組分別按相應(yīng)濃度給予黛黃芍藥散藥液灌胃2 mL。

1.3實驗儀器及試劑

60Co-γ照射裝置(軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學與輻射防護醫(yī)學研究所提供)，離心機(Sigma，1-15k)，OLYMPUS BX51顯微鏡，Image J1.48v圖像分析系統(tǒng)。COX-2一抗試劑盒(博奧森，批號：bs-10411R)，二抗試劑盒(中杉金橋，批號：15155A09)，TXB2試劑盒(美國Andygene公司，批號：HTLL30420)，6-Keto-PGF1α試劑盒(美國Andygene公司，批號：HTLN30143)，3%戊巴比妥鈉(德國，批號：k2208)。

1.4模型制備

各照射組大鼠于照射前8 小時禁食，除空白對照組外，其余組大鼠使用3%戊巴比妥麻醉，待大鼠肌肉完全松弛后，以仰臥體位將其四肢固定于特制照射板上，并置于距離60Co-γ源中心3 m、高1 m的照射臺上，照射野自恥骨聯(lián)合至肛門，照射野面積3 cm×4 cm，其余部位用厚5 cm的鉛磚屏蔽。采用一次性照射，總劑量為30 Gy，劑量率165.32 cGy/min，照射時間為18分12秒，空白對照組大鼠置相似環(huán)境中，但不予照射，以造模后大鼠出現(xiàn)稀便、黏液便或柏油樣便判定造模成功[5]，本實驗造模成功49只，成功率98%。

1.5取材及標本處理

照射第14天給藥12小時后，以3%戊巴比妥鈉行大鼠腹腔麻醉，取血后剖取肛門以上3 cm直腸組織，沿縱軸剪開，生理鹽水清洗凈，肉眼觀察其形態(tài)學變化。

1.6大鼠直腸COX-2測定

采用免疫組化法檢測直腸組織中COX-2的表達。每張切片隨機選取6個視野，顯微鏡下采集圖像，并用Image J1.48v圖像分析系統(tǒng)進行陽性顯色的平均積分光密度測定，取其均值作為平均光密度數(shù)值。

1.7TXB2、6-Keto-PGF1α含量的ELISA法檢測

于腹主動脈取血5 mL，滴入試管中，不抗凝，置室溫靜置2小時后，將其放入離心機中，4℃、3000 rpm，離心15分鐘，取上清液，采用ELISA法測定血清中TXB2及6-Keto-PGF1α濃度。

1.8統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1大鼠直腸肉眼觀察比較

正常對照組：肉眼可見大鼠直腸表面光滑，紋理清晰，未見出血點、糜爛及潰瘍。模型組：直腸皺壁形態(tài)不規(guī)則，充血明顯，大量點狀瘀斑形成，部分糜爛。地塞米松組：直腸黏膜中度水腫，腸壁增厚，偶見糜爛及潰瘍。中藥中劑量組：直腸形態(tài)欠規(guī)則，黏膜輕度水腫，腸腔變窄，少量潰瘍形成。中藥低、高劑量組：直腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整，點狀瘀斑不明顯。2.2黛黃芍藥散對放射性直腸炎大鼠組織COX-2的影響

結(jié)果顯示：直腸組織中COX-2表達主要位于細胞胞漿中，呈彌漫性的棕黃色顆粒，在空白對照組中表達量較少，而在各造模組中直腸組織炎癥區(qū)域的細胞中表達更為明顯。統(tǒng)計分析表明：與空白對照組相比，模型組COX-2表達量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組COX-2表達量呈現(xiàn)不同程度的降低(P<0.01)，其中以地塞米松組、中藥低劑量及高劑量組下降最為顯著；各中藥組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表1、圖1。

表1　各組大鼠直腸COX-2的比較

注： 與空白對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.01。

圖1　各組大鼠直腸COX-2免疫組化檢測結(jié)果(×400)

2.3黛黃芍藥散對放射性直腸炎大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α濃度及其比值的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清TXB2濃度及TXB2/6-Keto-PGF1α比值明顯升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α濃度明顯降低(P<0.01)，提示放射性直腸炎可引起大鼠血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α增高，6-Keto-PGF1α降低。與模型組比較，各給藥組TXB2濃度均顯著降低(P<0.01)，中藥高劑量組最低，中劑量組次之，提示黛黃芍藥散可降低放射性直腸炎大鼠血清中TXB2濃度；與地塞米松組比較，中藥中劑量及高劑量組TXB2濃度均較低(P<0.05)，提示黛黃芍藥散較地塞米松可有效降低放射性直腸炎大鼠TXB2水平。6-Keto-PGF1α濃度比較，各給藥組與模型組比較差異不明顯(P>0.05)。TXB2/6-Keto-PGF1α比值比較來看，各給藥組均低于模型組(P<0.01)，以中藥高劑量組最為明顯，中劑量組次之，提示黛黃芍藥散可有效降低放射性直腸炎大鼠血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α水平。見表2。

表2　各組大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α濃度及其比值

注： 與空白對照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01; 與地塞米松組相比，cP<0.05。

3　討論

正常條件下，直腸組織中COX-2含量較低，以維持機體正常生理活動。在病理過程中，NF-κB、PPAR-γ、TNF-α等多種炎癥因子刺激下，COX-2表達增加，并將花生四烯酸催化合成前列腺素類物質(zhì)，如血栓素A2(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)等，參與機體各種病理生理過程。TXA2和PGI2是一對重要的血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)腸道微循環(huán)中有重要作用。其中TXA2可促進血管收縮、血小板內(nèi)環(huán)腺苷酸的聚集和血栓形成，從而發(fā)揮止血作用。PGI2具有較強的舒張血管、抗血小板聚集和抑制血栓形成的作用[6]。TXA2與PGI2很不穩(wěn)定，在血液中迅速水解為TXB2與6-Keto-PGF1α，兩者相互拮抗[7]。在正常條件下，TXB2與6-Keto-PGF1α兩者維持一定比例，在受到輻射損傷時，TXB2與6-Keto-PGF1α濃度產(chǎn)生異常變化，兩者平衡失調(diào)，進而導(dǎo)致循環(huán)障礙、出血、血栓形成，引起腸黏膜微循環(huán)阻塞，加速炎癥反應(yīng)。

黛黃芍藥散為臨床經(jīng)驗方，由青黛、黃連、黃柏、牡丹皮、赤芍及血竭粉組成，具有清熱解毒、涼血止血、燥濕止瀉的功效。本實驗表明，黛黃芍藥散可有效減少放射性直腸炎大鼠COX-2和TXA2含量，平衡TXB2/6-Keto-PGF1α比值，且在降低TXB2水平方面，黛黃芍藥散高劑量較地塞米松效果顯著，在降低TXB2/6-Keto-PGF1α比值方面，黛黃芍藥散高、中劑量效果與地塞米松相當。因此，推測其作用機制可能是通過抑制COX-2的表達，減少TXA2的合成與釋放，從而調(diào)節(jié)TXB2與6-Keto-PGF1α比值，進而改善腸黏膜微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)。

以往的動物實驗主要集中于藥物對炎癥反應(yīng)的直接影響，本實驗著眼于炎癥反應(yīng)的放大因素——微血管血栓形成及其機制，從而為放射性直腸炎的研究提供新視角。

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(本文編輯： 董歷華)

Effect ofDaihuangShaoyaopowder on COX-2, TXB2and 6-Keto-PGF1αin rats with radiation proctitis

WANGYu-guo，DOUYong-qi，QINLi.

TraditionalChineseMedicineDepartmentofChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，China

Correspondingauthor：DOUYong-qi，E-mail：dyqi_301@yeah.net

ObjectiveTo explore the mechanism ofDaihuangShaoyaopowder on inhibiting thrombosis and improving the intestinal microcirculation in the rat model of radiation proctitis. MethodsSixty Wistar female rats were randomly divided into 6 groups, normal group, model group, dexamethasone group, high, mediumand, low dosage ofDaihuangShaoyaopowder groups. Rat models of radiation-induced proctitis were produced by60Co-γ ray radiation. The levels of COX-2, TXB2, 6-Keto-PGF1αand TXB2/6-Keto-PGF1αwere detected after drugs intervention for 14 days. ResultsCompared with the model group, the levels of COX-2, TXB2and TXB2/6-Keto-PGF1αwere obviously decreased in high dosage ofDaihuangShaoyaopowder (P<0.01). Compared with the model group,DaihuangShaoyaopowder groups could effectively reduce the level of COX-2,TXB2and TXB2/6-Keto-PGF1α(P<0.01). ConclusionDaihuangShaoyaopowder could effectively inhibit the formation of intestinal microvascular thrombosis, improve microcirculation, and the mechanism of action may be through controlling the expression of COX-2, which can reduce the synthesis and release of TXB2, and then adjust the ratio of the TXB2/6-Keto-PGF1 α.

DaihuangShaoyaopowder；Radiation-induced proctitis；Cyclooxygenase-2；Thromboxane B2；6-keto-prostaglandin F1α

全軍后勤科研計劃(AWS14C014)

100853北京，中國人民解放軍醫(yī)學院[王毓國(碩士研究生)、竇永起、秦麗(碩士研究生)]

王毓國(1991- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：放射性直腸炎的基礎(chǔ)與臨床研究。 E-mail：wangyuguo301@163.com

竇永起(1965- )，碩士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥治療惡性腫瘤。E-mail: dyqi_301@yeah.net

R285.5

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10.3969/j.issn.1674-1749.2016.09.003

2015-10-22)