陳自佳　于文靜　王素梅

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·論著·

脾虛證多發(fā)性抽動癥小鼠模型的建立及評價

陳自佳于文靜王素梅

目的建立脾虛證多發(fā)性抽動癥小鼠動物模型，初步了解該脾虛模型的一般特征。方法腹腔注射亞氨基二丙腈350 mg/(kg·d)結(jié)合濃度為1 g/mL的番瀉葉顆粒劑溶液20 mL/(kg·d)灌胃，連續(xù)8天，建立脾虛證多發(fā)性抽動癥小鼠模型。通過自主活動計數(shù)、刻板運動評分、體質(zhì)量、食量、大便粒數(shù)、胸腺及脾臟指數(shù)、胃泌素、D-木糖等指標(biāo)對脾虛證多發(fā)性抽動癥小鼠進(jìn)行評價。結(jié)果模型組、脾虛組小鼠造模后在相同的時間內(nèi)活動路程及平均速度較空白對照組明顯增加(P<0.05)，體質(zhì)量增加緩慢。脾虛組小鼠的食量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及胃泌素、D-木糖濃度均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論本模型抽動癥狀穩(wěn)定，具有脾虛證的某些癥狀，一定程度上具備了脾虛證多發(fā)性抽動癥的表面效度。

脾虛證；多發(fā)性抽動癥；模型評價

小兒多發(fā)性抽動癥(tourette syndrome,TS)是一種兒童時期常見的神經(jīng)精神疾病，以運動性抽動和(或)發(fā)聲性抽動為特征。隨著其發(fā)病率的逐漸增高，以及對患兒的心智發(fā)育和人格塑造所產(chǎn)生的不良影響，受到學(xué)者們的極大關(guān)注。隨著研究的進(jìn)展，以疾病動物模型為研究對象的基礎(chǔ)實驗逐漸暴露出無法觀察中醫(yī)證候改善、缺乏中醫(yī)辨證論治思路、難以與臨床相一致等問題。故建立并評價病證結(jié)合動物模型，即脾虛證TS小鼠模型，對中醫(yī)藥更深入的研究具有重要的意義。

建立病證結(jié)合模型目前有疾病動物模型觀察、西醫(yī)病理判斷、中醫(yī)的“病”結(jié)合“證”、西醫(yī)的“病”結(jié)合“證”等方法。各方法在不同的病、不同的證方面各有優(yōu)劣。李繼君等[1]采用脾虛肝亢證TS患兒未稀釋血清微量灌注于Wistar大鼠腦內(nèi)，制備出脾虛肝亢證TS大鼠模型，但制備方法復(fù)雜，且費用較為昂貴。針對TS的疾病特點及脾虛證的證候特點，結(jié)合課題組前期實驗及既往文獻(xiàn)，依據(jù)中醫(yī)病因發(fā)病學(xué)原理，本課題采用腹腔注射亞氨基二丙腈(iminodipropionitrile,IDPN)結(jié)合苦寒瀉下法建立脾虛證TS小鼠模型。

1　材料與方法

1.1實驗動物

ICR雄性小鼠30只，體質(zhì)量(18±2)g，清潔級，許可證編號：SCXK(京)2006-0009，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2實驗試劑

亞氨基二丙腈(批號：24859071，美國，Sigma-Aldrich)，0.9%氯化鈉注射液(批號：0906201w，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)，番瀉葉(批號：14014412，北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，人胃泌素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(批號：2402503，美國)，人D-木糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒(批號：2400231，美國)。

1.3實驗儀器

JJ2000型精密電子天平(美國雙杰兄弟集團有限公司)，ZIL-2小鼠自主活動程序自動控制儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，HDR-SR10E型SONY數(shù)碼攝錄一體機(日本索尼)，酶標(biāo)儀，洗板機，水浴箱，微量振蕩器。

1.4建立TS小鼠模型

ICR小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為空白組、模型組、脾虛組，12小時晝夜節(jié)律，自由攝食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。參照神經(jīng)毒素全身用藥法[2]及課題組前期實驗結(jié)果[3]，除空白對照組外，其余2組小鼠腹腔注射IDPN，350 mg/(kg·d)[IDPN原液用生理鹽水稀釋50倍，17 mL/(kg·d)]，空白對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)8天。

1.5建立脾虛模型

采用瀉下法對脾虛組10只小鼠進(jìn)行脾虛模型制備。從腹腔注射IDPN造模之日起，予番瀉葉顆粒劑溶液灌胃，20 mL/(kg·d)(番瀉葉顆粒劑溫水溶解，1 g/mL)，連續(xù)8天[4-5]。

1.6行為學(xué)測定

1.6.1自主活動次數(shù)測定參照文獻(xiàn)報道[6-7]，于實驗第8天腹腔注射及灌胃后進(jìn)行測定。采用小鼠自主活動程序自動控制儀隨機測定各組小鼠的自主活動。先將小鼠放入自主活動箱中，每個活動箱中1只，適應(yīng)環(huán)境5分鐘后進(jìn)入計算機程序，自動記數(shù)5分鐘內(nèi)小鼠的活動總路程及活動速度。為消除對小鼠自主活動的影響，每測定完1組小鼠，均需清潔自主活動箱中小鼠的排泄物。

1.6.2刻板運動觀察及評分參照Khan等[8]及衛(wèi)利[9]的方法，采用雙盲法觀察評分，分別于實驗第7天、14天、21天、28天各觀察及評分1次，每次觀察30分鐘。觀察15分鐘后開始評分，評分時間1分鐘，評分標(biāo)準(zhǔn)[2]：0分，無刻板運動；1分，旋轉(zhuǎn)行為；2分，頭頸部垂直運動；3分，頭頸部垂直運動和旋轉(zhuǎn)行為；4分，頭側(cè)擺，伴頭頸部垂直運動。

1.7脾虛證型測定

1.7.1一般表現(xiàn)觀察小鼠活動、形態(tài)、毛色、飲食、排便及腹形、體表被毛性狀等變化。

1.7.2體質(zhì)量測定分別于實驗第1天、7天、14天、21天、28天，測定小鼠體質(zhì)量。

1.7.3胃泌素及D-木糖定量測定實驗第28天行為學(xué)檢測后進(jìn)行血樣采集。眼眶球后取血1～2 mL，加入無菌試管中。室溫靜置2小時，4℃，3000 rpm，離心10分鐘，取血清0.5～1 mL，分裝凍存。分別采用人胃泌素酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人D-木糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行檢測。

1.7.4胸腺、脾臟指數(shù)眼眶取血后對小鼠進(jìn)行解剖，取胸腺、脾臟，稱重后計算胸腺及脾臟指數(shù)(胸腺指數(shù)mg/g=胸腺重量/體質(zhì)量；脾臟指數(shù)mg/g=脾臟重/體質(zhì)量)。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)測定

2.1.1一般表現(xiàn)模型組、脾虛組小鼠從實驗第7天開始可以觀察到小鼠在受到刺激(如提出籠外、腹腔注射等)后，比空白組更容易出現(xiàn)直立、攀爬、懸掛、洗臉等各種特殊行為。第8天腹腔注射完畢后均出現(xiàn)不同程度的頭部抽動、嗅、舔、活動增多等行為，保持某一姿勢不變的時間較空白組短，受刺激后活動愈加明顯。

2.1.2自主活動儀檢測模型組、脾虛組小鼠的活動總路程、平均速度較空白組小鼠明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組與脾虛組之間總路程、平均速度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　不同組別小鼠活動總路程±s)

注： 與空白組比較，aP<0.05。

2.1.3刻板運動觀察評分模型組、脾虛組小鼠在同時間節(jié)點刻板運動無明顯差異(P>0.05)。模型組小鼠第28天與第7天相比，刻板運動無顯著性差異(P>0.05)。脾虛小鼠第28天與第7天相比，刻板運動無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2　各組小鼠刻板運動評分

2.2脾虛證型測定

2.2.1一般表現(xiàn)各組小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)時，均精神良好，行動靈敏，毛色光澤，呼吸正常，飲食、飲水量正常，二便正常。隨著造模的進(jìn)行，脾虛組除與模型組小鼠同出現(xiàn)頭部抽動、旋轉(zhuǎn)行為外，體質(zhì)量增加緩慢(P>0.05，見表3)，食量下降，肛門輕微污穢，大便粒數(shù)增多，但無明顯神軟萎靡、毛色散亂、拱背、活動緩慢、反應(yīng)遲鈍等癥狀。

2.2.2胸腺及脾臟指數(shù)測定脾虛組小鼠與空白組、模型組小鼠相比，胸腺指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，脾臟指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

表4　胸腺及脾臟指數(shù)

注： 實驗過程中脾虛組脫失1例。

2.2.3血胃泌素和D-木糖濃度測定脾虛組小鼠與空白組、模型組小鼠相比，胃泌素?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，D-木糖濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表5。

表5　胃泌素及D-木糖濃度

注： 實驗過程中脾虛組脫失1例。

3　討論

參照文獻(xiàn)及ICR小鼠本身的特點，確定以小鼠的食欲不振(食量減少)、消瘦(體質(zhì)量下降)、大便溏瀉(拉尾排便次數(shù)增多，便形溏稀，肛門污穢)、倦怠乏力(懸空拉尾抵抗力減弱)、毛發(fā)不榮、拱背、萎靡嗜睡等癥狀、體征為脾虛證的主要診斷因素[7]。根據(jù)造模時間、造模方法的可行性等因素選擇腹腔注射IDPN及番瀉葉灌胃進(jìn)行脾虛證TS模型探索。IDPN的神經(jīng)毒性使小鼠出現(xiàn)頭部抽動、旋轉(zhuǎn)、嗅、舔等刻板運動，模擬了TS患兒不隨意運動增多(抽動)的表現(xiàn)[10]， 而且其表面效度可維持較長時間(至少1個月)，為中藥長時程干預(yù)治療提供了時間保障[11]。 TS小鼠受到神經(jīng)毒素本身或所模擬TS疾病的影響，體質(zhì)量偏低，與部分文獻(xiàn)中IDPN干預(yù)后

表3　各組小鼠體質(zhì)量

的實驗鼠體質(zhì)量降低的報道一致[8，12]，但總體仍呈增加趨勢。脾胃為水谷之海，后天之本，共司飲食的消化吸收。番瀉葉性苦寒，苦寒傷脾，脾胃失和，納化失職，出現(xiàn)食量下降，進(jìn)而導(dǎo)致體質(zhì)量增加緩慢。脾失健運，水濕不化，水谷不分，合污而下，則成便溏。

胸腺是動物細(xì)胞免疫的中樞器官，脾臟是動物最大的外圍免疫器官，胸腺、脾臟的發(fā)育狀態(tài)及機能強弱，直接決定著免疫水平。兩者在形態(tài)學(xué)上的退行性改變?yōu)槠⑻撟C的病理學(xué)依據(jù)之一[13]。 本實驗脾虛組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，與既往文獻(xiàn)所報道的脾虛組動物脾臟指數(shù)呈降低趨勢[14]有一定偏差，考慮與番瀉葉作用緩瀉等有關(guān)。

胃泌素(gastrin,GAs)又稱促胃液素，可促進(jìn)胃排空，激發(fā)胃竇平滑肌的收縮反應(yīng)，密切參與消化道結(jié)構(gòu)與功能的發(fā)育和成熟過程[15-17]，其水平下降程度與脾虛證嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。血清D-木糖含量是與小腸吸收功能成正相關(guān)的一個較為敏感和特異的檢測指標(biāo)[19-23]，其水平的變化可以較為客觀地反映小兒的消化吸收代謝功能[24]。脾失健運，脾不能運化水谷精微，物質(zhì)代謝就會發(fā)生障礙，表現(xiàn)在糖代謝方面，就會出現(xiàn)D-木糖吸收功能低下[25]。本實驗尚未能提供有力證據(jù)說明本脾虛證TS模型具有小腸吸收功能減弱的病理基礎(chǔ)。

ICR小鼠腹腔注射IDPN 350 mg/(kg·d)所誘導(dǎo)的TS模型穩(wěn)定，表面效度良好，可維持較長時間(至少1個月)。結(jié)合濃度為1 g/mL的番瀉葉顆粒劑溶液20 mL/(kg·d)灌胃，抽動癥狀穩(wěn)定，具有脾虛證的某些癥狀，一定程度上具備了脾虛證TS的表面效度。但總體而言，生物學(xué)特性與臨床尚存在一定的差距。

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(本文編輯： 蒲曉田)

Establishment and preliminary evaluation of a mouse model of tourette’s syndrome(TS) with spleen deficiency syndrome

CHENZi-jia,YUWen-jing,WANGSu-mei.

PaediatricDepartment，DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China

Correspondingauthor:WANGSu-mei,E-mail：wangsumei120@163.com

ObjectiveTo establish an animal model of TS in mouse with spleen deficiency syndrome, and to explore the general characteristics of the model of spleen deficiency. MethodsMice were intraperitoneal injected iminodipropionitrile 350 mg/(kg·d) and intragastric administration Senna granules solution 20 mL/(kg·d) for 8 days. The independent activity counts, stereotyped movement score, body weight, food intake, feces granu, thymus and spleen index, gastrin, D-xylose and other indexes were used to evaluate TS mouse of spleen deficiency. ResultsAfter modeling, the activity distance and average speed of model group and spleen deficiency group was significantly increased, and body weight increase slowly. Food intake of spleen deficiency group was decreased(P>0.05). Thymus index, spleen index, gastrin and D-xylose concentration had no significant difference. ConclusionThe TS model has stable symptoms and some symptoms of spleen deficiency syndrome, and it has the face validity of the syndrome of deficiency of the spleen.

Spleen deficiency;Tourette sydrome;Model evaluation

北京中醫(yī)藥大學(xué)青年教師項目(2013)

100078北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院兒科(陳自佳、王素梅)；北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒科(于文靜)

陳自佳(1984- )，女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥治療小兒多發(fā)性抽動癥。E-mail：13810648865@163.com

王素梅(1950- )，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥治療小兒神經(jīng)精神疾病。E-mail：wangsumei120@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.09.006

2016-01-19)