劉雪梅　陶冶　傅晨　王鳳麗　鄭宏　張?jiān)蕩X

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·論著·

從“腦心同病”探討急性腦缺血引發(fā)心肌損傷的動(dòng)態(tài)變化

劉雪梅陶冶傅晨王鳳麗鄭宏張?jiān)蕩X

目的觀察腦缺血不同時(shí)間引發(fā)心肌損傷的變化，明確“腦心同病”的生物學(xué)基礎(chǔ)。方法電凝法致大腦中動(dòng)脈閉塞建立急性腦缺血誘發(fā)心肌損傷大鼠模型，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、缺血6小時(shí)模型組、缺血12小時(shí)模型組和缺血24小時(shí)模型組，每組9只，記錄心電圖分析心率變異性，ELISA法測(cè)定血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)活性、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinI，cTnI)含量，HE染色法觀察腦、心組織形態(tài)學(xué)變化，HBFP染色法觀察心肌纖維形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果急性腦缺血明顯降低中頻段、高頻段、總頻段，中頻段與高頻段比值隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)；隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)，CK-MB、CTnI呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在缺血6小時(shí)達(dá)高峰；腦缺血6小時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)不清，部分胞核縮小并深染等缺血改變，隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，至腦缺血24小時(shí)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞嚴(yán)重。心肌細(xì)胞胞漿著色不均，心肌嗜酸性變；腦缺血6小時(shí)心肌纖維廣泛、彌漫親復(fù)紅染色，心肌發(fā)生早期病變，隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)心肌病變逐漸縮小、程度減輕。結(jié)論急性腦缺血能夠引發(fā)心肌損傷，心肌發(fā)生早期病變，心肌酶譜發(fā)生異常，可增加心肌酶活性、cTnI含量，在腦缺血6小時(shí)達(dá)到高峰，證實(shí)了腦心同病的生物學(xué)基礎(chǔ)。

急性腦缺血；心肌損傷；腦心同病

在中老年人群中，腦、心缺血性疾病普遍存在，且往往同時(shí)或先后發(fā)生而集于一身，可稱(chēng)之為腦心同病。目前臨床發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中伴發(fā)無(wú)癥狀冠心病的患者比率高達(dá)16.7%[1]；急性心梗并發(fā)腦卒中的發(fā)病率從1.0%～8.6%不等[2]，可見(jiàn)腦心同病在臨床是較為常見(jiàn)的現(xiàn)象，在治療上常采取相同的治療方法，達(dá)到了良好的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)心腦血管疾病發(fā)病部位雖然不同，但有著諸多相同的危險(xiǎn)因素或相似的發(fā)病機(jī)制。本研究采用電凝致大腦中動(dòng)脈閉塞方法,建立急性腦缺血大鼠模型，在此基礎(chǔ)上動(dòng)態(tài)檢測(cè)血清心肌酶活性，觀察心率變異性及心肌細(xì)胞、纖維病理形態(tài)學(xué)改變，以證實(shí)急性腦缺血對(duì)心肌的損傷作用，明確腦心同病的發(fā)病機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量(220±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要試劑、儀器。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)購(gòu)自FLUKA;CK-MB、cTnI試劑盒購(gòu)自RB公司。

電凝器(AESCULAP tb50)、雙極電凝鑷(TIMESCO)、自動(dòng)脫水機(jī)及石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)(LEICA)、正置顯微鏡(OLYMPUS)、多導(dǎo)電生理記錄儀(Biopac Systems)、酶標(biāo)儀(Bio-Teck ELx800)。

1.3動(dòng)物分組及局灶性腦缺血模型造模方法

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、缺血6小時(shí)模型組、缺血12小時(shí)模型組、缺血24小時(shí)模型組，共5組,每組9只。手術(shù)前12小時(shí)禁食、不禁水。

參照Tamura方法[3]并做相應(yīng)改進(jìn)，開(kāi)顱電凝大鼠大腦中動(dòng)脈，制備局灶性急性腦缺血模型。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，左側(cè)臥位固定大鼠于手術(shù)臺(tái)，右顳入路，沿顴弓下緣做一1.5 cm長(zhǎng)的皮膚切口，鈍性分離顳肌，切除少許下頜骨冠突，暴露鱗狀骨、上頜骨，小骨鉆鉆孔，打開(kāi)2×4 mm2骨窗，劃開(kāi)硬腦膜，清晰暴露右側(cè)大腦中動(dòng)脈近側(cè)段。電凝嗅束與大腦下靜脈之間的大腦中動(dòng)脈主干近側(cè)段，造成供血相關(guān)區(qū)梗塞灶，記錄梗塞開(kāi)始時(shí)間。假手術(shù)組除不電凝大腦中動(dòng)脈外，其他操作與模型組相同。

1.4觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1心率變異性分析各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)麻醉，大鼠右上、左下、右下肢皮下分別插入與MP100生理儀相連的不銹鋼針形電極，記錄心電圖信號(hào)。連續(xù)記錄ECG信號(hào)120秒，獲取低頻段(low frequency band，LF，0.04～0.20 Hz)、中頻段(midium frequency band，MF，0.21～0.60 Hz)、高頻段(high frequency band，HF，0.61～3.00 Hz)、總功率(total power，TP，0.04～3.00 Hz)，并計(jì)算中頻段與高頻段比值(MF/HF)。

1.4.2血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)活性、肌鈣蛋白I(cardiac troponinI, cTnI)含量測(cè)定各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，4℃ 3500 rpm離心10分鐘取上清。采用ELISA法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.3腦組織形態(tài)學(xué)觀察各組大鼠心臟灌注固定后取出大腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成4 μm厚度的石蠟切片。切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，0.5%伊紅復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察大腦皮層缺血區(qū)及其周?chē)M織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4心肌組織形態(tài)學(xué)觀察各組大鼠麻醉后快速摘取心臟，置于4%多聚甲醛中固定。心肌組織脫水、包埋、HE染色方法同上。光鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)變化。

1.4.5心肌纖維形態(tài)學(xué)觀察心肌組織固定、脫水、包埋及切片等步驟同HE染色。常規(guī)脫蠟水化處理后，明礬蘇木素染色，流水沖洗返藍(lán)，0.1%堿性復(fù)紅染色，純丙酮脫水，0.1%苦味酸丙酮分化，純丙酮脫水，酒精脫水，二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)變化。

表1　大鼠心率變異性變化

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1腦缺血不同時(shí)間對(duì)心率變異性分析

假手術(shù)組與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，腦缺血6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)模型組MF、HF、TF均明顯下降(P<0.01)，缺血各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LF、MF/HF值各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)MF/HF比值存在逐漸上升趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

2.2腦缺血不同時(shí)間對(duì)CK-MB活性和cTnI含量變化

CK-MB活性變化：假手術(shù)組與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，腦缺血6小時(shí)模型組CK-MB活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)；腦缺血12小時(shí)模型組較缺血6小時(shí)模型組CK-MB活性有所降低，但仍高于假手術(shù)組(P<0.01)；腦缺血24小時(shí)模型組CK-MB活性接近假手術(shù)組基礎(chǔ)值水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　大鼠血清CK-MB活性、cTnI含量變化

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01。

cTnI含量變化：假手術(shù)組與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，腦缺血6小時(shí)模型組cTnI含量明顯升高(P<0.01)；腦缺血12小時(shí)、24小時(shí)模型組cTnI含量接近假手術(shù)組水平，與假手術(shù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3腦缺血不同時(shí)間對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常及假手術(shù)組：神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，胞漿豐富，胞核呈藍(lán)色，核仁清晰可見(jiàn)；腦缺血6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)模型組的神經(jīng)細(xì)胞均可見(jiàn)不同程度的腫脹，細(xì)胞間隙增寬，出現(xiàn)細(xì)胞水腫現(xiàn)象，缺血12小時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，核仁消失，至缺血24小時(shí)時(shí)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯著破壞，脫失嚴(yán)重，核固縮，核仁不可見(jiàn)。見(jiàn)圖1。

A.假手術(shù)組

B.腦缺血6小時(shí)模型組

C.腦缺血12小時(shí)模型組

D.腦缺血24小時(shí)模型組

圖1腦缺血不同時(shí)間大鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)

2.4腦缺血不同時(shí)間對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常及假手術(shù)組：心肌細(xì)胞形態(tài)正常，肌原纖維排列有序，染色鮮艷均一，腦缺血6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)模型組的細(xì)胞胞漿著色不均，心肌嗜酸性改變，小部分心肌細(xì)胞胞核輕微固縮，出現(xiàn)凝固性壞死；可見(jiàn)收縮帶、波狀纖維。缺血24小時(shí)較缺血6小時(shí)、12小時(shí)胞漿著色不均范圍減少。見(jiàn)圖2。

2.5腦缺血不同時(shí)間對(duì)心肌纖維形態(tài)學(xué)變化

正常組及假手術(shù)組心肌纖維呈金黃色，心肌細(xì)胞胞核呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞間質(zhì)中紅色點(diǎn)狀顆粒為紅細(xì)胞；腦缺血6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)模型組均可見(jiàn)心肌纖維親復(fù)紅染色呈不同程度紅色，其中缺血6小時(shí)心肌纖維親復(fù)紅染色廣泛、彌漫分布，色深紅，提示大量的心肌組織發(fā)生了早期病理改變；隨著腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)，心肌纖維親復(fù)紅染色逐漸變淡，提示早期病變的心肌組織隨著腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)而開(kāi)始部分恢復(fù)。見(jiàn)圖3。

A.假手術(shù)組

B.腦缺血6小時(shí)模型組

C.腦缺血12小時(shí)模型組

D.腦缺血24小時(shí)模型組

圖2腦缺血不同時(shí)間心肌組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)

A.假手術(shù)組

B.腦缺血6小時(shí)模型組

C.腦缺血12小時(shí)模型組

D.腦缺血24小時(shí)模型組

圖3腦缺血不同時(shí)間心肌組織形態(tài)學(xué)改變(HBFP染色，×200)

3　討論

心率變異性(heart rate variability，HRV)是指竇性心律在一定時(shí)間內(nèi)周期性改變的現(xiàn)象，可定量評(píng)估心臟交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)的張力以及兩者的均衡性對(duì)心血管活動(dòng)的影響[4]，其降低可作為心律失常和心源性猝死的獨(dú)立預(yù)報(bào)指標(biāo)[5-6]。HRV由LF、MF和HF三個(gè)譜峰組成，MF受心臟交感與副交感神經(jīng)活動(dòng)的雙重影響；HF是檢測(cè)心臟副交感神經(jīng)活性的定量指標(biāo)；MF/HF比值反映心臟交感和副交感神經(jīng)活動(dòng)的平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后6～24小時(shí)MF、HF波段功率明顯降低，且隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)下降愈明顯，說(shuō)明交感、副交感神經(jīng)功能受損。隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)植物神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重，心臟可能因此發(fā)生繼發(fā)性損傷。既往臨床、實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)大腦中動(dòng)脈阻塞患者表現(xiàn)出MF、HF降低，MF/HF比值升高的現(xiàn)象[7-8]。

肌鈣蛋白是心肌損傷的特異性和敏感性指標(biāo)[9]，具有高度的心肌特異性；肌酸激酶同工酶為心肌特異性酶，在評(píng)判心肌損傷上有較好的靈敏度。本研究采用cTnI與CK-MB聯(lián)合評(píng)價(jià)心肌的損傷程度，結(jié)果顯示腦缺血早期心肌酶活性增強(qiáng)，說(shuō)明在腦缺血超早期心肌損傷已明確存在。在形態(tài)學(xué)上同時(shí)發(fā)現(xiàn)腦缺血后心肌細(xì)胞出現(xiàn)間質(zhì)水腫，心肌纖維受損。提示腦缺血早期容易造成心肌損傷，隨著腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)心肌病變減輕。這與文獻(xiàn)報(bào)道亦一致，急性腦卒中后肌鈣蛋白水平增加并有心肌缺血的心電圖改變，而且增加死亡危險(xiǎn)性，其機(jī)制可能與血液循環(huán)中兒茶酚胺水平增加有關(guān)[10]。

課題組認(rèn)為腦、心缺血性疾病的直接病變部位是絡(luò)脈。中風(fēng)、胸痹或因年老體衰，或因久病氣血虧損，腦絡(luò)、心絡(luò)失養(yǎng)；瘀血或痰飲內(nèi)停，而致腦絡(luò)、心絡(luò)阻滯不通；情志、瘀血或痰飲郁而化火，進(jìn)一步損傷腦絡(luò)、心絡(luò)，腦絡(luò)損傷發(fā)為中風(fēng)，心絡(luò)損傷發(fā)為胸痹[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)急性腦缺血大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，梗死周?chē)鷧^(qū)神經(jīng)細(xì)胞水腫、胞漿稀疏淡染，胞核固縮；心肌組織出現(xiàn)缺血缺氧早期病變，心肌酶譜異常，證實(shí)了腦絡(luò)損傷進(jìn)而損傷心絡(luò)。腦絡(luò)損傷，腦功能受損、形質(zhì)敗壞，局部正氣愈虛、邪氣愈盛，熾盛之邪以絡(luò)脈網(wǎng)絡(luò)為通道橫竄心絡(luò)，引起心功能損傷、甚至結(jié)構(gòu)變化。腦、心損傷皆以絡(luò)脈損傷為起始，以功能、結(jié)構(gòu)改變?yōu)榻K點(diǎn)結(jié)局，病絡(luò)機(jī)制是腦心同病的共性機(jī)制，急性腦缺血誘發(fā)心肌損傷的發(fā)生發(fā)展、相互影響的時(shí)空動(dòng)態(tài)過(guò)程體現(xiàn)了病絡(luò)機(jī)制的演變規(guī)律和腦心同病的發(fā)病機(jī)制。

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(本文編輯： 禹佳)

Dynamic change from the “Naoxin Tongbing” on myocardial injury induced by acute cerebral ischemia

LIUXue-mei,TAOYe,FUChen,etal.

DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

Correspondingauthor:ZHANGYun-ling,E-mail：yunlingzhang2004@163.com

ObjectiveTo observe the dynamic change of myocardial injury induced by cerebral ischemia, and determine the biological basis of “Naoxin Tongbing”. MethodsRat model of middle cerebral artery occlusion was established by electro-coagulation technique. Rats were randomly divided into five groups: normal group, sham group, ischemia 6 h, 12 h, 24 h model groups. Heart rate variability was recorded by ECG; Creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB) activity, cardiac troponinI(cTnI) content was detected by ELISA; Morphological changes of cerebral tissue was observed by HE staining and HBFP staining. ResultsAcute cerebral ischemia could decrease MF, HF and TF, MF/HF has an increased tendency. Serum CK-MB activity and cTnI content was increased at first and then decreased，which peaked at 6 h of ischemia. HE staining in the cerebral tissues showed the phenomena of disorganization，neurons edema, quantity decreased and nuclear condensation. The cardiac tissue of HE staining showed chromatosis light, mild coagulation necrosis; 6 hours after cerebral ischemia, myocardial fibers were extensive and diffuse, and the early pathological changes were gradually reduced, and the extent of myocardial lesions decreased with the time of ischemia. ConclusionAcute cerebral ischemia could cause myocardial injury and lead to early myocardial change, increased serum CK-MB activity and cTnI content, which peaked at 6h of cerebral ischemia. It was confirmed the biological basis of “Naoxin Tongbing”.

Acute cerebral ischemia；Cardiac injury；Naoxin Tongbing

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB518406);國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)(2015DFA31130)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81173233)

100078北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心[劉雪梅、陶冶、傅晨、王鳳麗、鄭宏、張?jiān)蕩X]

劉雪梅(1979- )，女，博士，副研究員。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腦病基礎(chǔ)研究。E-mail：liuxuemei04@126.com

張?jiān)蕩X(1963- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)腦病臨床與機(jī)制研究。E-mail:yunlingzhang2004@163.com

R542.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.09.004

2016-05-10)