常 亮，郭海龍，黨 巖

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000）

甘肅東部地區(qū)羊口瘡病毒PCR檢測(cè)調(diào)查

常 亮，郭海龍，黨 巖

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000）

本研究以GenBank上羊口瘡病毒（ORFV）保守基因B2L序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物并合成，建立了羊口瘡病毒PCR檢測(cè)方法，運(yùn)用建立的診斷方法對(duì)甘肅省東部地區(qū)4種養(yǎng)羊模式下羊采血樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，四種類型養(yǎng)羊場(chǎng)采集的羊血樣ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率分別為52.2%、25.8%、59.4%和37.8%，說(shuō)明本病在甘肅東部地區(qū)羊中廣泛存在，且感染率很高，也證明建立的PCR方法在羊口瘡病毒檢測(cè)和快速診斷中具有良好的檢測(cè)效果。

甘肅東部地區(qū)；羊口瘡病毒；PCR檢測(cè)

羊口瘡，又稱羊接觸傳染性膿皰皮炎或羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿瘡，是由羊口瘡病毒感染引起的綿羊、山羊接觸性、嗜上皮性傳染病［1］，以口唇等處的皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂為特征，羊群的發(fā)病率高達(dá)90%，病死率1%-25%［2］，造成了養(yǎng)羊業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失。人、犢牛、駱駝等也可感染本病。

本病在甘肅省存在歷史已久，分布廣泛，從上世紀(jì)中葉起就有羊口瘡的報(bào)道和研究［3］，近幾年隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和飼喂模式的改進(jìn)，羊口瘡在羊呈不斷擴(kuò)展、蔓延之勢(shì)，亦有多處羊只感染羊口瘡病例的臨床報(bào)道，影響了甘肅省養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展［4］。由于本病與羊感染口蹄疫病毒、羊痘病毒臨床癥狀相似，特別在繼發(fā)感染或混合感染難以區(qū)分，這就為本病的確診增加了難度。為了準(zhǔn)確、快速檢測(cè)本病，建立了羊口瘡病毒PCR檢測(cè)方法，并對(duì)甘肅東部地區(qū)4種飼養(yǎng)管理模式下羊口瘡病毒的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

羊口瘡病毒、山羊痘病毒毒株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床血樣采自甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)、慶陽(yáng)市環(huán)縣，低溫保存。

PCR試劑 （TaqDNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP），DNAMarker、瓊脂糖等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中ORFV較保守的B2L基因序列，設(shè)計(jì)引物1對(duì)，上游引物為P1：5'-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3'，下游引物P2：5'-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段大小為540bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。

1.2.2臨床血樣中DNA的提取

取血樣200μL，依次加入00μL滅菌雙蒸水、400μL6mol/L的碘化鈉、800μL氯仿-異戊醇（24：1），顛倒混勻，14000r/min離心10min；吸上層水相500μL，加入300μL異丙醇，80μL3mol/L醋酸鈉，混勻后-20℃靜置 10min，14000r/min離心10min；棄上清，加70%乙醇1mL，混勻，14000r/ min離心5min，棄去乙醇，晾干，加20μL滅菌雙蒸水4℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

25μL反應(yīng)體系：10×PCRBuffer（含 Mg2+）2.5μL、dNTP混合物（各2.5mmol/L）3μL、TaqDNA聚合酶 （2.5U/μL）0.2μL、上引物P1、P2（10pmol/ μL）各 1.0μL、DNA模板 2.5μL、滅菌雙蒸水（ddH2O）加至25μL。

經(jīng)優(yōu)化后PCR條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

取擴(kuò)增產(chǎn)物8μL與溴酚藍(lán)緩沖液2μL混勻，加樣于2%瓊脂糖凝膠中，電泳后，觀察結(jié)果。

1.2.4臨床樣品的檢測(cè)

用建立的PCR方法對(duì)臨床血樣進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR結(jié)果

從圖1看出，用ORFV提取的病毒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約540bp的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小相一致；健康羊血樣DNA未擴(kuò)增出條帶。結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明建立的該方法可用于羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的擴(kuò)增。對(duì)照（山羊痘病毒）；3.陽(yáng)性對(duì)照（ORFV病毒煮沸稀釋103倍）；4-5.ORFV病毒DNA；6-7.健康羊血樣提取DNA后擴(kuò)增產(chǎn)物

圖1　ORFVB2L基因序列PCR擴(kuò)增

2.2檢測(cè)圖例

從圖2看出，臨床血樣中4號(hào)、10號(hào)、12號(hào)和13號(hào)樣品擴(kuò)增出和ORFV病毒大小一致的條帶，說(shuō)明這4份血樣中帶有羊口瘡病毒，證實(shí)這四只羊已被羊口瘡病毒感染。

圖2　血樣中羊口瘡病毒檢測(cè)圖例

表1　不同飼養(yǎng)管理模式下羊口瘡病毒檢出情況

2.2檢測(cè)結(jié)果

從表1中可以看出，四種類型養(yǎng)羊模式下羊場(chǎng)采集的羊血樣，ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率分別為52.2%、25.8%、59.4%和37.8%，說(shuō)明本病在甘肅東部地區(qū)廣泛存在且感染率很高。

2.3分析

四種類型的羊只養(yǎng)殖模式中，環(huán)縣的養(yǎng)殖小區(qū)ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率最高，因?yàn)轲B(yǎng)殖小區(qū)內(nèi)小養(yǎng)殖戶多，羊群來(lái)源混雜、相互傳染，加之各養(yǎng)殖戶飼喂、管理、疫病防治意識(shí)參差不齊且不斷有養(yǎng)殖戶退出和新養(yǎng)殖戶加入，圈舍、料槽、地面等存在消毒不徹底等問(wèn)題，這也是羊群感染率高原因之一。平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)是西北的牛羊屠宰、加工、銷(xiāo)售集散地，崆峒區(qū)的養(yǎng)羊場(chǎng)多為異地收羊－－短期育肥-集中屠宰模式，羊群構(gòu)成復(fù)雜、羊只流動(dòng)頻繁，這也是羊群ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率高原因之一。環(huán)縣規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)選址科學(xué)、廠區(qū)布局合理，羊群的管理、飼喂、配種、免疫、消毒制度健全，羊只發(fā)病少，生產(chǎn)效率高。環(huán)縣個(gè)體養(yǎng)羊戶羊舍，一般是家庭院舍、舊房改造或近幾年新建，相對(duì)獨(dú)立，羊群接觸少、相互感染機(jī)會(huì)小，ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率相對(duì)較低。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示和采集血樣時(shí)養(yǎng)殖戶、基層獸醫(yī)反映，證實(shí)近年來(lái)羊口瘡在羊群中的發(fā)病率高。究其原因，主要有以下兩個(gè)因素：首先，血采集樣的甘肅東部養(yǎng)羊業(yè)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)舍飼化，羊口瘡高發(fā)期的春、秋季，飼喂的幾乎全部為陰干苜?；蛘咔噘A秸稈，相對(duì)放牧?xí)r的采食的野干草、灌木松軟，羊只發(fā)病癥狀輕或者口唇、舌、鼻等部無(wú)明顯劃傷和結(jié)痂，沒(méi)有引起養(yǎng)殖戶注意；其次，羊口瘡多發(fā)于3-6月齡的羔羊，但病毒會(huì)長(zhǎng)期攜帶，故ORFV檢測(cè)陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于發(fā)病率。

3小結(jié)與討論

羊口瘡在所有養(yǎng)羊的國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生，以澳大利亞、新西蘭等國(guó)最為嚴(yán)重。我國(guó)甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、西藏、四川和云南等省區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。羊口瘡在臨床上分為唇型、蹄型和外陰型，以唇型感染為主，其特征為口唇等處皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。羊痘、羊口蹄疫的臨床癥狀與羊口瘡極為相似，臨床上容易誤診。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)羊口瘡的方法較多，如電子顯微鏡檢查、病毒分離、接種試驗(yàn)和AGP等方法［5-7］。瓊脂免疫擴(kuò)散法診斷ORFV，需要3－6周的時(shí)間才可出現(xiàn)較高效價(jià)的抗體，周期太長(zhǎng)；電子顯微鏡檢查羊口瘡病毒簡(jiǎn)單直觀，但電子顯微鏡價(jià)位較高、操作復(fù)雜，臨床應(yīng)用上受到限制；病毒分離培養(yǎng)也需要較高的要求和較長(zhǎng)的時(shí)間，因此也不宜進(jìn)行推廣。

本研究選擇GenBank上羊口瘡病毒（ORFV）保守基因B2L序列，用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物并合成，建立了羊口瘡病毒PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的引物能擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為540bp左右，與預(yù)期大小一致；本方法檢測(cè)山羊痘病毒為陰性，檢出羊口瘡病毒最低量為5pg，具有良好的特異性和敏感性，可用于臨床病料檢測(cè)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本方法檢測(cè)羊口瘡病毒，快速、簡(jiǎn)單、有準(zhǔn)確，且試驗(yàn)條件要求不高，適合于一般的實(shí)驗(yàn)室，易于推廣。

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中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，3（9）：21-23.

S858.26

A

1003-8655（2016）04-0098-02

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：GNSW-2013-25）。

∶常亮（1982-），甘肅靜寧人，本科，助理研究員，主要從事動(dòng)物病毒性傳染病防治技術(shù)的研究工作。