劉振國(guó)王紅芳王 穎郭興啟李興安胥保華（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安708；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安708；吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林08）

功能基因組學(xué)驅(qū)動(dòng)蜜蜂系統(tǒng)生物學(xué)研究

劉振國(guó)1王紅芳1王 穎1郭興啟2李興安3胥保華1
（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安271018；3吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108）

在生命科學(xué)研究蓬勃發(fā)展的后基因組學(xué)時(shí)代，系統(tǒng)生物學(xué)已成為研究復(fù)雜生命現(xiàn)象的重要手段和研究熱點(diǎn)。以高通量組學(xué)技術(shù)為技術(shù)平臺(tái)，研究特定生理狀態(tài)下大量基因、蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物等生物大分子的表達(dá)模式變化規(guī)律，有助于建立與生物表型變化的相關(guān)性，為探究生理過(guò)程的分子調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。本文總結(jié)了廣泛應(yīng)用的多種組學(xué)的研究進(jìn)展，同時(shí)對(duì)該技術(shù)在蜜蜂領(lǐng)域的研究加以綜述，為蜜蜂系統(tǒng)生物學(xué)研究提供重要參考資料。

蜜蜂；系統(tǒng)生物學(xué)；功能基因組學(xué)

系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology）是研究生物系統(tǒng)中所有不同性質(zhì)的組成成分（基因、mRNA、蛋白質(zhì)、生物小分子等）的構(gòu)成、以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系的學(xué)科。顯然，系統(tǒng)生物學(xué)是以整體性研究為特征、以實(shí)現(xiàn)從基因序列到功能網(wǎng)絡(luò)、到細(xì)胞、到組織、到個(gè)體的各個(gè)層次的整合為研究目標(biāo)的綜合學(xué)科，以期復(fù)雜的生理?xiàng)l件下可靠地反映出生物系統(tǒng)的真實(shí)性。然而，針對(duì)單一方向研究生命科學(xué)無(wú)法解釋系統(tǒng)生物學(xué)問(wèn)題，而以個(gè)體或群體為單位，針對(duì)生命過(guò)程中全部基因、蛋白質(zhì)表達(dá)模式或產(chǎn)物代謝途徑的組學(xué)研究應(yīng)運(yùn)而生。為基因組學(xué)研究提供了新的視點(diǎn)，極大地豐富了后基因組學(xué)方面的研究手段，使得系統(tǒng)生物學(xué)與細(xì)胞生物化學(xué)緊密聯(lián)系在一起，揭示基因間、基因與環(huán)境互作關(guān)系，為闡明致病機(jī)制、遺傳變異、進(jìn)化過(guò)程等生物學(xué)所面臨和亟待解決的問(wèn)題提供大數(shù)據(jù)支持。

蜜蜂是重要的授粉昆蟲(chóng)和模式生物。近年來(lái)，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多變使得蜜蜂的生存面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)，種群數(shù)量銳減危害了農(nóng)作物生產(chǎn)和生態(tài)多樣性［1］。資料顯示，群體崩潰紊亂（Colony collapse disorder，CCD）導(dǎo)致美國(guó)蜂群2008年保有量較1947年驟降了近61%［2］，這一比例在2014年下降為42.1%，但其原因尚未清晰。蜜蜂的學(xué)習(xí)和記憶等生物行為學(xué)一直受到關(guān)注。蜜蜂的基因組測(cè)序完成［3，4］，促進(jìn)了以高通量組學(xué)技術(shù)為手段的蜜蜂系統(tǒng)生物學(xué)研究，本文綜述了近年來(lái)廣泛應(yīng)用的基因組學(xué)分析技術(shù)的研究進(jìn)展及其在蜂學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

1　基因組學(xué)研究方法

基因組（genome）是研究基因組及其功能的學(xué)科。如今涉及生命科學(xué)的研究大多是基于基因組學(xué)科之上而發(fā)展起來(lái)的，帶動(dòng)了該領(lǐng)域的研究在觀念認(rèn)識(shí)和技術(shù)方法上的飛躍。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因組學(xué)成果日新月異。以Roche公司的454測(cè)序平臺(tái)、Illumina公司的Solexa測(cè)序系統(tǒng)以及ABI公司的SOLID測(cè)序系統(tǒng)為代表的新一代測(cè)序技術(shù)，降低測(cè)序成本的同時(shí)極大地提高了測(cè)序速度，拓展了基因測(cè)序的應(yīng)用范圍，尤其促進(jìn)了系統(tǒng)生物學(xué)研究和分子診斷方法的革新。為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏基因組學(xué)研究等方面帶來(lái)全新的變化，并逐步深入到微生物學(xué)研究領(lǐng)域中［5］，而在腸道微生物的研究中提出了宏基因組學(xué)（Megagenomics）和宏蛋白質(zhì)組學(xué)（Metaproteomics）的概念［6］，擺脫了微生物培養(yǎng)技術(shù)瓶頸的局限性。而腸道微生物無(wú)論是從菌體數(shù)量還是編碼基因數(shù)目上都遠(yuǎn)超機(jī)體本身，因此被認(rèn)為是機(jī)體除自身基因組外的第二套基因組，其組分變化與疾病健康的關(guān)系等在研究中受到重視。腸道微生物在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、抵抗某些病原菌的侵襲和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面具有重要作用［7］，為蜜蜂健康養(yǎng)殖、環(huán)境評(píng)價(jià)等提供了新思路［8］，極大地豐富了后基因組學(xué)方面的研究手段，使得系統(tǒng)生物學(xué)與細(xì)胞生物化學(xué)緊密聯(lián)系在一起，揭示基因間、基因與環(huán)境互作關(guān)系，為闡明致病機(jī)制、遺傳變異、進(jìn)化過(guò)程等生物學(xué)所面臨和亟待解決的問(wèn)題提供大數(shù)據(jù)支持。

蜜蜂是典型的社會(huì)性昆蟲(chóng)，其高度組織、分工明確的社會(huì)形態(tài)是由染色體倍數(shù)和基因選擇性表達(dá)所控制的。同時(shí)蜜蜂的智慧也常常令人感到驚嘆，所以通過(guò)蜜蜂系統(tǒng)生物學(xué)的研究，不僅揭示了蜜蜂起源和進(jìn)化的奧秘，同時(shí)也加深了對(duì)蜜蜂社會(huì)行為的理解。自2006年西方蜜蜂（Apis mellifera）全基因組測(cè)序公布以來(lái)，蜜蜂科學(xué)研究亦進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代，功能基因組學(xué)研究使得蜜蜂生命科學(xué)的研究逐步從單個(gè)基因擴(kuò)大到全基因組的修飾、表達(dá)調(diào)控和功能研究，建立了生物大分子物質(zhì)變化與機(jī)體表型之間的關(guān)聯(lián)性，極大地促進(jìn)了后基因組時(shí)代蜜蜂生理生化、營(yíng)養(yǎng)需求、病蟲(chóng)害防治、健康福利等方面的研究，也為解決蜜蜂面臨的諸多威脅制定防護(hù)策略。

功能基因組學(xué)（functional genomics）是確定基因組所有基因及其產(chǎn)物的生物學(xué)功能的科學(xué)［9］。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷革新，目前涉及關(guān)鍵作物、畜禽、模式生物和靈長(zhǎng)類等全基因組序列已測(cè)序完成并相繼公布（表1），使得人們?nèi)媪私鉁y(cè)序物種的基因結(jié)構(gòu)組成、表達(dá)調(diào)控、進(jìn)化變異等信息，極大地促進(jìn)了系統(tǒng)生物學(xué)的深入研究，為解決全球糧食、能源及工業(yè)原料短缺問(wèn)題、促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增效、加速新品種培養(yǎng)、制定疾病解決方案具有重要戰(zhàn)略意義。

宏基因組學(xué)（Megagenomics）概念，使研究者們運(yùn)用深度測(cè)序手段對(duì)特定環(huán)境中的微生物群落進(jìn)行大規(guī)模分析，研究微生物群落多樣性及評(píng)估其代謝功能［10，11］，以期探索微生物間、微生物與宿主間互利共生、相互競(jìng)爭(zhēng)的動(dòng)態(tài)平衡的復(fù)雜關(guān)系。美國(guó)科學(xué)院院士南?！つm（Nancy Moran）開(kāi)辟了蜜蜂腸道微生物學(xué)的研究［12］，奠定了蜜蜂腸道微生物系統(tǒng)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物多樣性的變化從營(yíng)養(yǎng)代謝以及疾病免疫等多方面影響著傳粉昆蟲(chóng)的健康狀況和種群演化。

2　基因組學(xué)在蜜蜂系統(tǒng)生物學(xué)中的研究進(jìn)展

2.1基因組學(xué)研究奠定了蜜蜂模式生物的地位

蜜蜂作為重要的授粉昆蟲(chóng)和模式生物，是繼果蠅（Drosophila melanogaster）、蚊子（Anopheles gambiae）之后第三種全基因組被破譯的昆蟲(chóng)，其基因組信息先后于2006年（意大利蜜蜂，A.mellifera）［3，13］和2014年（東方蜜蜂，A.cerana）［4］公布，發(fā)現(xiàn)蜜蜂（A.mellifera）具有的16對(duì)染色體中包含約2.6億個(gè)堿基對(duì)（約為人類基因組的1/10），編碼約1萬(wàn)個(gè)有效基因，比果蠅和蚊子的基因總數(shù)少30%左右。蜜蜂基因組約有170個(gè)與氣味感受器有關(guān)的基因，是果蠅和按蚊的2倍；而與嗅覺(jué)感受器相關(guān)的基因只有10個(gè)，遠(yuǎn)不及果蠅的68個(gè)和按蚊的76個(gè)［14］，這與蜜蜂需要通過(guò)氣味辨識(shí)敵我和尋找合適的花朵等行為有關(guān)。另外，蜜蜂擁有的個(gè)體免疫相關(guān)基因數(shù)量只有果蠅和蚊子的1/3［15］，但是它們有一套完整的被稱之為“social immunity”［16］的協(xié)作性為抵御蜂巢內(nèi)的病蟲(chóng)害，包括清潔巢房、梳理行為等［17］。另外，工蜂將具有抗菌功效的蜂膠涂抹在巢房?jī)?nèi)壁，導(dǎo)致蜜蜂免疫相關(guān)基因較少［18］。表皮碳水化合物合成系統(tǒng)、Notch信號(hào)通路相關(guān)基因被認(rèn)為是蜜蜂抵御細(xì)菌侵染的有效基因［19，20］。

社會(huì)性的蜜蜂為研究神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)、行為學(xué)和進(jìn)化學(xué)等提供良好的素材，是極高科研價(jià)值的模式生物。隨著蜜蜂全基因組學(xué)研究的不斷深入，基因功能和調(diào)控機(jī)制成為新的研究熱點(diǎn)。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，蜜蜂與其他物種一樣，被不斷選擇演變，繁衍成昆蟲(chóng)綱中“高級(jí)進(jìn)化”的類群，依賴的是群體行為學(xué)。Sarma等［21］以西方蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂這3個(gè)蜂種中研究具有舞蹈行為的采集蜂中樞神經(jīng)系統(tǒng)為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)蘑菇體中基因表達(dá)差異極大，而中腦和次級(jí)胸神經(jīng)節(jié)則表達(dá)一致性很高，多數(shù)與新陳代謝和能量供應(yīng)有關(guān)。從差異表達(dá)基因反映了不同蜂種巢內(nèi)活動(dòng)、社會(huì)生態(tài)和舞蹈行為的差別，也解釋了中腦和次級(jí)胸神經(jīng)節(jié)在調(diào)節(jié)舞蹈行為中的作用方式，指出蘑菇體是控制學(xué)習(xí)、記憶和節(jié)律行為的重要組織。陳璇［22，23］對(duì)不同發(fā)育階段的三型蜂的全基因組miRNA測(cè)序結(jié)果表明，在4個(gè)樣本中ame-bantam、ame-mir-279c、ame-mir-750和amemir-14的表達(dá)量最高，預(yù)示這些miRNA可能在雌蜂L4和L5發(fā)育階段的基本生命活動(dòng)中至關(guān)重要，并得到免疫系統(tǒng)（ame-mir-14）、大腦相關(guān)功能發(fā)育（ame-mir-34和ame-mir-317）的miRNA表達(dá)，為研究miRNA對(duì)蜜蜂發(fā)育、級(jí)型分化提供依據(jù)。秦秋紅［24］通過(guò)利用miRNA測(cè)序技術(shù)和Solexa數(shù)字基因表達(dá)標(biāo)簽分析技術(shù)（DGE）分析了迷宮視覺(jué)對(duì)東、西方蜜蜂miRNAs和mRNAs的表達(dá)影響，認(rèn)為前者對(duì)顏色和光柵圖形的學(xué)習(xí)與記憶能力均顯著強(qiáng)于后者。研究發(fā)現(xiàn)處理組40差異表達(dá)的miRNAs和45個(gè)差異表達(dá)基因（共388個(gè)）上調(diào)表達(dá)；得到一些與神經(jīng)學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的miRNAs，如miR-124，let-7，miR-9a和mir-1000等，和差異表達(dá)mRNA，如GABAA beta、煙堿型乙酰膽堿受體、TWKSPDIVIRFa-containing神經(jīng)肽和突觸結(jié)合蛋白等，分析了MAPK/ERK途徑對(duì)蜜蜂記憶中的作用，闡述了西方蜜蜂經(jīng)迷宮視覺(jué)學(xué)習(xí)后大腦內(nèi)miRNAs和mRNAs的表達(dá)量差異，為研究蜜蜂大腦學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)功能奠定基礎(chǔ)。

表1　基因組信息公布的主要物種①

2.2基因組學(xué)研究提供了蜜蜂進(jìn)化水平的依據(jù)

基因組學(xué)是研究物種進(jìn)化和分類的重要手段。一般認(rèn)為蜜蜂起源于非洲［25］，可追溯到1億年前的恐龍時(shí)代，但也有證據(jù)表明蜜蜂起源于30萬(wàn)年前的中亞。Wallberg等［26］通過(guò)研究世界各地14個(gè)居群的140種蜜蜂的SNP的遺傳變異模式，結(jié)果顯示蜜蜂具有高水平的遺傳多樣性，并對(duì)蜜蜂可能起源于亞洲這一觀點(diǎn)提供了基因組序列進(jìn)化樹(shù)數(shù)據(jù)支持。此外，蜜蜂屬9個(gè)種中，有8個(gè)種在東南亞地區(qū)仍然有繁盛的野生種群［27］。因此，該研究從進(jìn)化和遺傳適應(yīng)性角度為蜜蜂研究提供了新的見(jiàn)解，為研究抗逆性和氣候適應(yīng)性的生物學(xué)機(jī)制提供分子基礎(chǔ)，有助于制定全球范圍內(nèi)的蜜蜂保護(hù)策略。Pinto等［28］利用線粒體DNA tRNAleu-cox2和SNP測(cè)序數(shù)據(jù)分析了歐洲黑蜂保種群體的基因多態(tài)性和滲透水平，并與非保種群進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)，非保種群基因滲透率達(dá)30%，高于保種群的8%，反應(yīng)出前者SNP變異程度較大，并認(rèn)為SNP技術(shù)是檢驗(yàn)保種群體的基因多態(tài)性有效手段。養(yǎng)蜂活動(dòng)和貿(mào)易促進(jìn)了地區(qū)間蜂種的基因交流等構(gòu)建了“祖先信息標(biāo)記”（AIMs，ancestry-informative markers）計(jì)算模式，包含F(xiàn)st及其異值化檢測(cè)、Delta值、In和PCA等參數(shù)，為研究歐洲蜂的品種鑒定和雜合水平提供依據(jù)，有助于制定蜜蜂保種規(guī)劃。Chapman等［30］在非洲蜜蜂、東方蜜蜂、歐洲蜜蜂和西歐蜂種獲得了95個(gè)差異的SNP，為檢測(cè)蜂群中非洲蜜蜂血統(tǒng)所占比例和篩選優(yōu)良生產(chǎn)性狀的蜂種提供可靠依據(jù)。

2.3基因組學(xué)研究推動(dòng)了蜜蜂健康養(yǎng)殖的發(fā)展

宏基因組在腸道微生物研究中的應(yīng)用廣泛。Cox-Foster等［31］運(yùn)用基于16S rDNA和18S rDNA高通量焦磷酸技術(shù)的測(cè)序手段對(duì)世界范圍內(nèi)多個(gè)地區(qū)的蜜蜂腸道微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IAPV與CCD的發(fā)生甚為密切，后者在各地造成了不同程度的蜂群崩潰，嚴(yán)重威脅蜂業(yè)發(fā)展以及生態(tài)平衡。Cornman等［32］以西方蜜蜂白堊病的致病菌子囊球菌［33］（Ascosphaera apis）的轉(zhuǎn)錄組水平研究致病機(jī)理，通過(guò)454焦磷酸測(cè)序得到拼接成10，087條contigs，預(yù)測(cè)得到6，992個(gè)編碼蛋白的基因，發(fā)現(xiàn)了一些編碼毒力因子和水解酶（特別是幾丁質(zhì)酶），有助于病菌突破宿主的防御機(jī)制（如幼蟲(chóng)的食圍膜和蛹期的角質(zhì)層），最終使宿主致死。分析表明黃曲霉毒素-柄曲霉素（Aflotoxin-Sterigmatocystin，ST）合成通路中，AflR（AAPI16014）是調(diào)節(jié)AF/ST的轉(zhuǎn)錄，StcU/ Verl（AAPI15087）在曲霉菌的毒素合成中起重要作用。Aufauvre等［34］通過(guò)測(cè)定微孢子蟲(chóng)和殺蟲(chóng)劑對(duì)中腸轉(zhuǎn)錄組蜜蜂的影響，發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期作用沒(méi)有顯著影響解毒相關(guān)基因，但會(huì)抑制免疫相關(guān)基因的表達(dá)。微孢子蟲(chóng)的侵染會(huì)強(qiáng)烈的改變中腸的免疫水平和海藻糖含量。李繼蓮等［35］通過(guò)Roche 454高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定了分布在我國(guó)境內(nèi)的青海、內(nèi)蒙古、廣西、四川、安徽等地區(qū)28種熊蜂的腸道細(xì)菌的16S的V6-V8區(qū)域，結(jié)果表明熊蜂腸道微生物存在兩種保守的生態(tài)型：一種是由Gilliamella和Snodgrassella菌群組成，這兩類菌群在蜜蜂中也存在；另一種生態(tài)型主要是由環(huán)境性菌群組成，而且含有一些條件致病菌如哈夫尼菌屬（Hafnia）和沙雷氏菌屬（Serratia）。這兩種不同生態(tài)型在熊蜂腸道微生物中的出現(xiàn)顯示出與哺乳動(dòng)物腸道微生物生態(tài)型分化的高度一致，對(duì)于熊蜂物種的健康和種群動(dòng)態(tài)具有潛在的影響，為進(jìn)一步挖掘這些特定腸道共生菌的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為我國(guó)蜂種資源的多樣性保護(hù)提供參考。

3　小結(jié)

功能基因組學(xué)研究已滲透到生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域，從腸道微生物組到傳染性病毒，從發(fā)育生物學(xué)到癌癥發(fā)生機(jī)制等多個(gè)方面，展現(xiàn)了蓬勃的生機(jī)及廣泛的應(yīng)用性，為系統(tǒng)生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具。如今，高通量測(cè)序已從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入了臨床檢驗(yàn)，借助分子標(biāo)記物進(jìn)行患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，做到有效的監(jiān)測(cè)、預(yù)警和干預(yù)，蜜蜂研究中尚有諸多問(wèn)題亟待解決。因此，將高通量組學(xué)技術(shù)運(yùn)用到蜜蜂研究領(lǐng)域，有助于探索蜜蜂遺傳因素與環(huán)境因素作用方式，促進(jìn)抗病育種、發(fā)展健康養(yǎng)殖和保持物種多樣性，對(duì)維持生態(tài)平衡具有重要意義。

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Functional genomics based application stimulate the future prospects in honeybee systems biology research

Liu Zhenguo1，Wang Hongfang1，Wang Ying1，Guo Xingqi2，Li Xing an3，Xu Baohua1
（1 College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China；2 College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China；3 Jilin Provincial Institute of Apicultural Science，Jilin 132108，China）

High-throughput studies of biological systems are rapidly accumulating a wealth of'omics'-scale data which have allowed researchers to better assess the complexity and diversity of the system biology in the post-genome era.Omics-based applications such as genome，transcriptome and proteome have been performed in various bioscientific researches for the integrated visualizations that give biological insight into the profiles of abundant of gene，protein and metabolite etc，well benefit the construction of the relationship between the traits and biomacromolecule as well as the molecular regulation mechanism of certain physiological processes.The current understanding and processing of widely used omics-based applications are summarized in this review，also with emphasis on its performance and achievement in honeybee research.

honeybee；systems biology；functional genomics

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31572470）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)蜜蜂及蠶桑新品種培育”（2014-2016）；國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（No.CARS-45）

劉振國(guó)（1984-），男，在站博士后，主要從事蜜蜂營(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)研究，E-mail：lzhenguo_001@163.com

胥保華（1965-），男，教授，主要從事蜜蜂營(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)研究，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn