張建武，　郭　爽，　李一榮

武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗科，武漢　430071

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miR-19b、miR-29c及其靶基因表達(dá)在鼻咽癌發(fā)病中的作用*

張建武，郭爽，李一榮△

武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗科，武漢430071

目的探討miR-19b、miR-29c及其靶基因表達(dá)在鼻咽癌發(fā)病中的作用。方法選擇2012年7月至2015年7月武漢大學(xué)中南醫(yī)院收治的70例鼻咽癌患者作為鼻咽癌組，57例慢性鼻咽炎患者作為鼻咽炎組，另選擇同期在醫(yī)院體檢的健康人群40例作為對照組，抽取3組血液樣本，采用熒光定量PCR檢測3組血清miR-19b、miR-29c表達(dá)；收集鼻咽癌組、鼻咽炎組組織樣本，采用Western blot檢測靶基因SOCS-1、COL1A-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參照，鼻咽癌組血清miR-19b、miR-29c相對表達(dá)量分別為(374.91±14.16)和(6.84±0.27)，鼻咽炎組分別為(171.53±7.82)和(2.14±0.07)，對照組分別為(168.95±8.05)和(2.08±0.05)，鼻咽癌組血清miR-19b、miR-29c相對表達(dá)量顯著高于鼻咽炎組和對照組(均P<0.05)，鼻咽炎組和對照組miR-19b、miR-29c表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，鼻咽癌組SOCS-1蛋白表達(dá)顯著低于鼻咽炎組(P<0.05)，鼻咽炎組與鼻咽癌組COL1A-1蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)性分析顯示，血清miR-19b與SOCS-1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.573，P<0.01)；miR-29c與COL1A-1無相關(guān)性(r=0.148，P=0.291)。結(jié)論鼻咽癌組血清miR-19b、miR-29c表達(dá)顯著升高，可以作為鼻咽癌診斷的潛在標(biāo)志物；miR-19b可能通過調(diào)節(jié)靶基因SOCS-1參與了鼻咽癌的發(fā)生。

鼻咽癌；微小RNA；靶基因；相關(guān)性；分子通路

微小RNA(micro RNA，miRNA)是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一種非編碼RNA，只有經(jīng)過剪切、加工的miRNA才能表達(dá)出相應(yīng)的生物學(xué)功能[1-2]。Gadducci等[3]報道稱miRNA主要參與30%以上人類蛋白編碼基因，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。miRNA既受到表觀遺傳的控制，也是一種調(diào)控因子調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。Paulsen等[4]稱miRNA能夠通過甲基化過程誘導(dǎo)沉默表達(dá)的抑癌基因再次表達(dá)，從而介導(dǎo)腫瘤生長的調(diào)控。由于miRNA在血液中表達(dá)相對穩(wěn)定，因此更適用于作為腫瘤分子標(biāo)志物。EB病毒感染是鼻咽癌發(fā)病的主要誘因，由于EB病毒屬于編碼miRNA的病毒，因此檢測相應(yīng)的miRNA表達(dá)水平會有助于鼻咽癌的診斷及預(yù)后評估[5]。本研究檢測鼻咽癌患者血清miR-19b、miR-29c和組織靶基因細(xì)胞因子信號負(fù)調(diào)控因子-1(suppressors cytokine sigmaling，SOCS-1)、Ⅰ型膠原蛋白(collagen 1 A1，COL1A-1)表達(dá)水平，旨在探討miR-19b、miR-29c分子信號通路對鼻咽癌發(fā)病的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

本研究經(jīng)中南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，選擇2012年7月至2015年7月武漢大學(xué)中南醫(yī)院收治的70例鼻咽癌患者作為鼻咽癌組，同期醫(yī)院收治的57例慢性鼻咽炎患者作為鼻咽炎組，鼻咽癌組男38例，女32例，年齡21～78歲，平均(57.1±6.8)歲，按照分化程度分為低分化腫瘤18例，中分化腫瘤29例，高分化腫瘤23例；按照美國癌癥聯(lián)合委員會[6](American Joint Committee on Cancer，AJCC)鼻咽癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期25例，Ⅳ期10例。鼻咽炎組男31例，女26例，年齡19～81歲，平均(56.9±6.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實，病理活檢時保留患者組織標(biāo)本；②入組前未進行放療、化療及手術(shù)治療；③告知患者及家屬研究方案，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；②經(jīng)抗癌治療后復(fù)發(fā)者。另選擇同期在醫(yī)院體檢的健康人群作為對照組，男19例，女21例，年齡18～76歲，平均(57.0±6.2)歲，對照組均排除鼻咽病變、惡性腫瘤者，三組受試對象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2主要儀器與試劑

RNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，SOCS-1、COL1A-1單克隆抗體購自Santa Cruz公司，美國ABI GeneAmp 9700 PCR儀。

1.3方法

1.3.1血清miR-19b、miR-29c表達(dá)量檢測采用熒光定量PCR檢測3組血清miR-19b、miR-29c表達(dá)[7]：抽取3組受試對象肘靜脈血3 mL，800 g離心10 min，吸取上清液置于EP管中，―80℃冰箱保存待檢。按照RNA提取試劑盒說明書提取血清總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-19b擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)后72℃ 5 min；miR-29c擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個循環(huán)后72℃ 5 min。記錄檢測指標(biāo)的Ct值，每組測量3次，取平均值，以β-actin為內(nèi)參，計算miR-19b、miR-29c相對表達(dá)量(2―ΔΔCt)。

1.3.2靶基因SOCS-1、COL1A-1蛋白表達(dá)檢測采用Western blot檢測SOCS-1、COL1A-1蛋白表達(dá)水平：將樣本充分研磨后加入蛋白裂解液(199 μL RAPI+1 μL PMSF)冰上充分裂解30 min，4℃、1 400 g離心10 min，留取上清液，置于―80℃冰箱保存待檢。配置好上樣緩沖液，沸水中變性5 min，冰浴5 min；SDS-PAGE電泳分離蛋白，將電泳段轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS沖洗3次，分別加入兔抗人SOCS-1多克隆抗體和羊抗人COL1A-1多克隆抗體，室溫孵育1 h，4℃過夜；PBS沖洗3次；再分別加入熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗)，室溫下振搖1 h，PBS沖洗3次。熒光圖像掃描及條帶灰度值分析，目的蛋白相對表對量為樣本條帶與GAPDH條帶灰度值之比。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1血清miR-19b、miR-29c擴增產(chǎn)物的驗證

對目的基因擴增產(chǎn)物進行驗證，結(jié)果顯示內(nèi)參照β-actin長度約為100 bp，目的基因miR-19b、miR-29c擴增長度約為54 bp，與文獻(xiàn)報道[8]結(jié)論相符，且電泳帶中無明顯雜帶，證實提取RNA無污染，目的基因符合要求，見圖1。

M：Marker，1：β-actin，2：miR-19b，3：miR-29c圖1　血清miR-19b、miR-29c擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of serum miR-19b and miR-29c

2.23組受試對象血清miR-19b、miR-29c表達(dá)量

以β-actin作為內(nèi)參照，鼻咽癌組血清miR-19b、miR-29c相對表達(dá)量分別為(374.91±14.16)和(6.84±0.27)，鼻咽炎組分別為(171.53±7.82)和(2.14±0.07)，對照組分別為(168.95±8.05)和(2.08±0.05)，鼻咽癌組血清miR-19b、miR-29c相對表達(dá)量顯著高于鼻咽炎組和對照組(均P<0.05)，

鼻咽炎組和對照組miR-19b、miR-29c表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見圖2。

2.3SOCS-1、COL1A-1蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot檢查結(jié)果顯示，鼻咽癌組SOCS-1蛋白表達(dá)顯著低于鼻咽炎組(P<0.05)，鼻咽炎組與鼻咽癌組COL1A-1蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

與鼻咽癌組比較，*P<0.05圖2　3組受試對象血清miR-19b、miR-29c相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of miR-19b and miR-29c in three groups

1、2、3、4：鼻咽炎組，5、6、7、8：鼻咽癌組圖3　鼻咽癌組、鼻咽炎組SOCS-1、COL1A-1蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 Protein expression levels of SOCS-1 and COL1A-1 in nasopharyngeal carcinoma group and nasopharyngitis group

2.4相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，血清miR-19b與SOCS-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系((r=―0.573，P=0.000)；miR-29c與COL1A-1表達(dá)無相關(guān)性(r=0.148，P=0.291)。

3　討論

鼻咽癌是與EB病毒感染有關(guān)的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯區(qū)域性。在我國，廣東、廣西和福建地區(qū)發(fā)病率較高[8-9]。鼻咽癌治療的關(guān)鍵在于早期診斷，臨床調(diào)查[10]顯示Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌患者5年生存率約為80%～85%，而Ⅲ～Ⅳ期患者5年生存率降低至50%～60%。鼻咽部解剖結(jié)構(gòu)較為特殊，且早期發(fā)病隱匿，給臨床診療帶來一定困難。EB病毒檢測是鼻咽癌篩查的方法之一[11]，然而其他如乳腺癌、胃癌發(fā)病也與EB病毒感染有關(guān)，對于檢測EB病毒陽性患者不能排除其他惡性腫瘤的可能。李璐等[12]也報道稱約30%鼻咽癌患者EB患者檢測陰性，因此單純血清EB病毒檢查亦存在一定假陰性的風(fēng)險。微小RNA(miRNA)是近年來研究較多的一類RNA，國外研究[13]證實，正常人體內(nèi)miRNA表達(dá)基本一致，然而對于惡性腫瘤患者，miRNA表達(dá)卻呈現(xiàn)明顯差異。Jagdis等[14]報道稱血液中miRNA主要來源于腫瘤組織，與其他生物標(biāo)記物相比，血miRNA檢測屬于無創(chuàng)操作，即使對于發(fā)病較為隱蔽的部位也可以及時診斷。此外，血miRNA具有抗酸、抗堿等特點，其穩(wěn)定性較好，是一種理想的腫瘤分子標(biāo)志物。

miR-19b、miR-29c是鼻咽癌研究較多的2種miRNA，潛伏膜蛋白l(LMP1)是EB病毒主要編碼蛋白[15]，在LMP1表達(dá)陽性的鼻咽癌細(xì)胞株中，miR-19b顯著升高，提示miR-19b可能參與了LMP1表達(dá)過程，導(dǎo)致EB病毒感染，最終發(fā)展成鼻咽癌。miR-19b屬于miR-17-92家族成員之一，在細(xì)胞的增殖、分化方面發(fā)揮著重要作用。張濰等[16]研究稱非小細(xì)胞肺癌患者miR-19b表達(dá)顯著升高，并激活白細(xì)胞介素-6(IL-6)信號途徑參與腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)。SOCS通過參與多種細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為。有研究[17]證實SOCS-1是miR-19b的主要靶基因，當(dāng)miR-19b表達(dá)上調(diào)后，會作用于SOCS-1的JAK/STAT通路，并通過抑制負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制干擾腫瘤細(xì)胞凋亡等過程。本研究顯示鼻咽癌組血清miR-19b表達(dá)顯著高于鼻咽炎組和對照組，提示在鼻咽癌中，miR-19b表達(dá)上調(diào)，并啟動相應(yīng)的分子信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖。為了驗證miR-19b的信號通路，本研究對SOCS-1蛋白表達(dá)進行分析，結(jié)果顯示鼻咽癌組SOCS-1蛋白表達(dá)顯著低于鼻咽炎組，提示miR-19b高表達(dá)會抑制靶基因SOCS-1的表達(dá)，使JAK/STAT通路受阻，使腫瘤細(xì)胞“逃離”JAK/STAT通路的監(jiān)測。相關(guān)性分析也證實血清miR-19b與SOCS-1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明miR-19b是鼻咽癌發(fā)病的一個主要誘因之一，血清miR-19b檢測也可以作為鼻咽癌診斷的潛在分子標(biāo)志物。王晨等[18]也報道稱miR-19b與SOCS-1 mRNA可以相互抑制對方的翻譯過程，影響STAT通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖，促進鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

miR-29c屬于miR-29家族成員，馬筱秋等[19]采用基因芯片檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-29c在胃癌患者中表達(dá)水平顯著升高。關(guān)于miR-29c作用機制目前研究很少，有報道[20]稱miR-29c過表達(dá)會改變細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的行為，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力顯著增強。Bae等[21]也證實miR-29c能夠降低層黏連蛋白、基質(zhì)金屬蛋白和膠原蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲。COL1A-1屬于Ⅰ型膠原蛋白，被認(rèn)為是miR-29c靶基因之一[22]。本研究對miR-29c、COL1A-1表達(dá)進行檢測，結(jié)果顯示鼻咽癌組血清miR-29c表達(dá)顯著高于鼻咽炎組和對照組，然而鼻咽炎組與鼻咽癌組COL1A-1蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示miR-29c與靶基因COL1A-1分子通路可能不是鼻咽癌發(fā)病機制，相關(guān)性分析也顯示miR-29c與COL1A-1無相關(guān)性。當(dāng)然機體內(nèi)細(xì)胞因子、靶基因的調(diào)控機制錯綜復(fù)雜，也不能排除其他因素參與了調(diào)節(jié)過程，因此這一信號通路對鼻咽癌診療是否有價值依然需要進一步證實。

綜上所述，鼻咽癌組血清miR-19b、miR-29c表達(dá)顯著升高，可以作為鼻咽癌診斷的潛在標(biāo)志物；miR-19b可能通過調(diào)節(jié)靶基因SOCS-1參與了鼻咽癌的發(fā)生。

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(2016-04-30收稿)

Role of miR-19b，miR-29c and Their Target Genes in Nasopharyngeal Carcinoma

Zhang Jianwu，Guo Shuang，Li Yirong△

MedicalLaboratoryofZhongnanHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430071，China

ObjectiveTo explore the role of miR-19b，miR-29c and their target genes in the development of nasopharyngeal carcinoma.MethodsA total of 70 nasopharyngeal carcinoma patients treated in Zhongnan Hospital of Wuhan University from July 2012 to July 2015 were selected as nasopharyngeal carcinoma group，57 patients with chronic nasopharyngitis as nasopharyngitis group，and another 40 healthy individuals as control group.Blood samples were collected from the three groups.The expression of miR-19b and miR-29c was detected by real-time quantitative PCR in the three groups.The expression levels of target genes SOCS-1 and COL1A-1 protein were detected by Western blotting in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngitis tissues.ResultsWith β-actin as an internal reference，the relative expression levels of miR-19b and miR-29c were(374.91±14.16)and(6.84±0.27)in nasopharyngeal carcinoma group，(171.53±7.82)and(2.14±0.07)in nasopharyngitis group，and(168.95±8.05)and(2.08±0.05)in control group.They were significantly increased in nasopharyngeal carcinoma group as compared with those in nasopharyngitis group and control group(P<0.05 for all).There was no significant difference in the expression of miR-19b and miR-29c between nasopharyngitis group and control group(P>0.05).Western blotting showed that the expression of SOCS-1 was much lower in nasopharyngeal carcinoma group than that in nasopharyngitis group(P<0.05).There was no significant difference in the expression of COL1A-1 protein between the nasopharyngeal carcinoma group and the nasopharyngitis group(P>0.05).Correlation analysis showed that serum miR-19b was negatively correlated with SOCS-1(r=-0.573，P<0.01)，and miR-29c had no correlation with COL1A-1(r=0.148，P=0.291).ConclusionThe levels of serum miR-19b and miR-29c were significantly increased in patients with nasopharyngeal carcinoma，which suggested that serum miR-19b and miR-29c may be used as a potential marker for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.miR-19b may be involved in the occurrence of nasopharyngeal carcinoma by regulating the target gene SOCS-1.

nasopharyngeal carcinoma；micro RNA；target gene；correlation；molecular pathway

，Corresponding author，E-mail:liyirong838@163.com

R739.6

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.018

*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81371779)

張建武，男，1970年生，主管檢驗師，E-mail:zangjw13579@163.com