賈茜鈺　劉勤　白慧玲　董文

·臨床研究·

黃芪對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中HIF-1α 和VEGF表達的影響

賈茜鈺劉勤白慧玲董文

目的：研究中藥黃芪對不同時間段大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（RIRI）實驗過程中缺氧誘導因子1-α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法：將78只SD大鼠分為正常組、黃芪組和缺血再灌注組，前房加壓法造模，黃芪組及缺血再灌注組分為6h、12h、24h、48h、3d和7d以上6各時間段處死大鼠，取材，行免疫組織化學法測定大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α和VEGF表達的變化。結(jié)果：正常組大鼠視網(wǎng)膜中均未觀察到HIF-1α和VEGF的表達，缺血再灌注組6只中均可檢測到HIF-1α的表達，缺血再灌注6h即可檢測到HIF-1α表達，24h達到相對高峰，黃芪組各時間段表達低于缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。缺血再灌注后12h后缺血再灌注組和黃芪組開始出現(xiàn)VEGF的表達，48h達到高峰。各時間點黃芪組VEGF表達水平明顯低于缺血再灌注組視網(wǎng)膜中VEGF表達水平，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：中藥黃芪能改善對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷所致的相關缺血缺氧損害，可能通過抑制RIRI后視網(wǎng)膜中HIF-1α與VEGF的表達為主要機制，缺氧誘導因子-1α與內(nèi)皮生長因子的表達率均隨著RIRI時間的推移而表達升高，HIF-1α可能通過上調(diào)VEGF的蛋白表達，它們共同參與了損傷視網(wǎng)膜缺血再灌注的發(fā)生以及發(fā)展。

黃芪；大鼠視網(wǎng)膜；缺血再灌注損傷；HIF-1α；VEGF

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI）主要發(fā)生在青光眼、缺血性視神經(jīng)病變、增值性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管性疾病、新生兒視網(wǎng)膜病變等眼部疾病，是眼科臨床診療工作中常見的視網(wǎng)膜病理過程，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生機制尚不完全清楚，但研究表明可能與眾多因素密切相關［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明中藥黃芪［2］對各個器官組織細胞的缺血、缺氧損傷具有保護作用，如肝臟缺血再灌注、心肌缺血再灌注損傷等。研究表明黃芪還可以通過營養(yǎng)相關神經(jīng)組織抑制缺氧缺血，缺氧誘導因子-1 （hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是缺氧誘導因子的細胞核提取物中存在的DNA結(jié)合蛋白，是能夠反映缺氧調(diào)節(jié)的重要因子并能抑制細胞的生長，在缺氧的條件下可誘導相關細胞凋亡［3］。HIF-1α通過介導和調(diào)控相關轉(zhuǎn)錄因子從而適應機體組織的缺氧調(diào)節(jié)，缺血缺氧所導致的新生血管形成主要原因為氧化應激反應［4］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是目前促進血管生成的最重要因子之一，在缺氧缺血誘導的新生血管生成中起重要作用［5］。本實驗通過建立SD大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，觀察視網(wǎng)膜中缺氧誘導因子-1α及血管內(nèi)皮生長因子的相關表達，探討中藥黃芪對RIRI的保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組實驗動物選用健康成年、裂隙燈下檢查眼前節(jié)均正常SD大鼠78只，雌雄各半，體重（220±20）g［由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供動物，合格證號：SCXK（甘）2011-0001C］。正常對照組6只（無任何處理，每個時間點直接處死）；其余72只大鼠按隨機數(shù)字表法分為2組:黃芪組36只，RIRI造模前7d開始黃芪注射液（神威藥業(yè)有限公司、10mg），6g/kg進行腹腔注射，每日1次，直至處死；缺血再灌注組36只，RIRI造模前7d開始同等體積生理鹽水進行腹腔注射，每日1次，直至處死；按缺血再灌注時間將黃芪組和缺血再灌注組分為6 h、12 h、24 h、48 h、3d和7 d組，每小組6只。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注模型的建立。實驗模型采用大鼠眼球前房內(nèi)生理鹽水灌注法［6］。每只SD大鼠稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠至睡眠狀態(tài)，后將大鼠取俯臥位鼠臺上固定后，1%丁卡因滴眼液點眼進行雙眼局部麻醉，復方托吡卡胺滴眼液進行大鼠雙眼散瞳，生理鹽水沖洗雙眼結(jié)膜囊，生理鹽水瓶輸液管連接7號頭皮針，沿大鼠顳側(cè)眼角鞏膜緣將頭皮針針頭刺入大鼠眼球前房（應注意眼球前房刺入時應避免虹膜、晶狀體的損傷），為固定針頭用醫(yī)用膠布粘于大鼠眼球同側(cè)耳緣處。慢慢升高生理鹽水輸液瓶的高度直至輸液瓶與大鼠眼球垂直距離為150cm，輸液瓶與大鼠眼球高度至150cm可使大鼠眼內(nèi)壓升高至110mmHg（1mmHg=0.133 kPa），可觀察到大鼠球結(jié)膜、虹膜漸漸變白，輸液瓶與大鼠眼球高度至150cm時大鼠眼球結(jié)膜及虹膜為蒼白改變，直接眼底鏡可觀察到大鼠視網(wǎng)膜顏色蒼白，表明大鼠供給視網(wǎng)膜血流的視網(wǎng)膜中央動脈的阻斷。1h后將生理鹽水輸液瓶高度緩慢降與大鼠眼球水平狀態(tài)，繼而關閉輸液器開關，拔出輸液針頭，造模期間妥布霉素滴眼液頻繁點眼以預防感染并保持角膜濕潤，拔出針頭后觀察到球結(jié)膜以及虹膜顏色由蒼白恢復正常，直接眼底鏡下可見大鼠視網(wǎng)膜變?yōu)殚偌t色，表明大鼠視網(wǎng)膜的缺血動脈為重新開放，紅霉素眼膏涂雙眼結(jié)膜囊，造模完畢，等待大鼠清醒后回籠。

1.2.2標本取材、固定及切片。不同時間段各組大鼠腹腔注射過量水合氯醛處死后，立即摘除眼球，大鼠眼視神經(jīng)可保留0.5～1.0mm，隨后將眼球置于4%多聚甲醛內(nèi)常溫固定24 h，去除眼前節(jié)，剝離視網(wǎng)膜，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，制成石蠟切片，常規(guī)石蠟包埋。

1.2.3免疫組織化學檢測。每個組織塊均取3μm的切片用于免疫組化染色。將3μm的切片常規(guī)脫蠟至水，加入3%H2O2，95℃微波10分鐘將抗原修復，加入兔抗鼠HIF-lα（1∶300）抗體一抗（美國immnunoway公司），以0.1 mol/L的PBS代替一抗作為陰性對照。溫度保持4℃過夜，PBS緩沖液沖洗，滴加生物素標記二抗，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）顯色，自來水沖洗，蘇木精復染1min，脫水透明后封片處理，觀察并采集圖像。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）免疫組化檢測滴加（1∶200）一抗-小鼠抗大鼠VEGF單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），其余步驟同HIF-lα。

1.2.4計算機圖像分析。切片組織中細胞（細胞核、細胞質(zhì)或細胞膜）顯示出較多棕黃色顆粒為陽性表達，無棕黃色顆粒顯現(xiàn)則為陰性表達。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件計算陽性細胞的平均吸光度，舊稱光密度（OD），每張切片隨機取3個視野。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗測試指標的數(shù)據(jù)資料以平均數(shù)±標準差（±s）表示，對各組視網(wǎng)膜平均光密度值（A值）進行單因素方差分析并進行兩兩比較。

2　結(jié)果

2.1視網(wǎng)膜中HIF-1α蛋白的表達正常組未能檢測到HIF-1α的表達（圖1）。缺血再灌注組HIF-1α在再灌注后6h開始出現(xiàn)陽性表達，在24h表達最強，主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層表達（圖2）。黃芪組HIF-1α的表達變化規(guī)律同缺血再灌注組，但是6組時間點HIF-1α的表達量均低于缺血再灌注組（圖3）。視網(wǎng)膜缺血再灌注各時段HIF-Ia蛋白IOD值，見表1。

2.2視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的表達正常組及缺血再灌注組、黃芪組缺血再灌注后6h均未見VEGF的表達（圖4），缺血再灌注組在再灌注后12h主要在視錐視桿細胞層、INL和RGCs層開始出現(xiàn)VEGF的表達，表達逐漸增加，RIRI后48h表達達到高峰（圖5），繼而血管內(nèi)皮生長因子的表達漸弱，7d時仍可檢測到VEGF的表達。除RIRI后6h外，其余各個時間點黃芪組VEGF蛋白的表達均較缺血再灌注組明顯減弱（圖6）。表2為每組RIRI各時段VEGF蛋白的平均光密度（IOD）的變化，缺血再灌注組和黃芪組與正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1　正常組未見HIF-1α（×400）

圖2　缺血再灌注組可見HIF-1α（×400）

圖3　黃芪組HIF-1α表達減弱（×400）

表1　視網(wǎng)膜缺血再灌注各時段HIF-1α蛋白平均IOD值的變化（±s）

表1　視網(wǎng)膜缺血再灌注各時段HIF-1α蛋白平均IOD值的變化（±s）

注:與正常組比較bP＜0.05；與缺血再灌注組比較aP＜0.05

組別　n　6h　12h　24h　48h　3d　7d正常組　6　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03缺血再灌注組　6　0.172±0.03b　0.311±0.04b　0.361±0.04b　0.320±0.05b　0.252±0.04b　0.224±0.03b黃芪組　6　0.121±0.03ba　0.200±0.04ba　0.301±0.03ba　0.240±0.04ba　0.199±0.03ba　0.184±0.04ba

圖4　正常組未見VEGF表達（×400）

圖5　缺血再灌注組VEGF強陽性表達（×400）

圖6　黃芪組VEGF陽性表達明顯減弱（×400）

表2　視網(wǎng)膜缺血再灌注各時段VEGF蛋白平均IOD值的變化（±s）

表2　視網(wǎng)膜缺血再灌注各時段VEGF蛋白平均IOD值的變化（±s）

注:與正常組比較bP＜0.05；與缺血再灌注組比較aP＜0.05

組別　n　6h　12h　24h　48h　3d　7d正常組　6　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03缺血再灌注組　6　0.075±0.04b　0.219±0.05b　0.420±0.06b　0.510±0.06b　0.320±0.06b　0.220±0.05b黃芪組　6　0.072±0.04ba　0.189±0.04ba　0.280±0.05ba　0.349±0.06ba　0.219±0.04ba　0.151±0.04ba

3　討論

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的疾病，如青光眼、缺血性視神經(jīng)病變、增值性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管性疾病、新生兒視網(wǎng)膜病變等眼部疾病。青光眼發(fā)病后能造成眼組織，特別是視網(wǎng)膜的損傷，關于高眼壓造成視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等組織損傷的機理有較多研究，循環(huán)障礙和軸漿流學說得到較多的支持，近年來自由基學說對各種疾病的病理生理過程的研究起到重要作用。急性高眼壓時視網(wǎng)膜氧分壓降低、缺血、缺氧，導致了一系列的代謝障礙及病理學改變。視網(wǎng)膜血管性疾病中視網(wǎng)膜中央動脈阻塞通常發(fā)生于視乳頭鞏膜篩板或后部，少許也可以發(fā)生于篩板前，視網(wǎng)膜氧分壓也降低，出現(xiàn)一系列的缺血缺氧病理狀態(tài)。本實驗運用大鼠前房生理鹽水灌注法造成視網(wǎng)膜血管斷流形成大鼠RIRI模型，實驗中將輸液瓶高度保持150cm從而形成14.63 kPa的壓力能夠造成大鼠視網(wǎng)膜血管斷流，這與大鼠的體循環(huán)收縮壓相接近，造模成功后應用免疫組化方法檢測RIRI后視網(wǎng)膜HIF-1α及VEGF表達情況；探討黃芪對HIF-1α和VEGF表達的影響。HIF-1α的靶基因產(chǎn)物如GLUTs-1、VEGF、HO-1、iNOS及編碼p21、BcL-2等基因在相關腫瘤的細胞代謝、新生血管生成、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中也具有重要的作用。HIF-1α可調(diào)節(jié)VEGF表達從而促新生血管形成［7］。

中藥黃芪作為祖國的傳統(tǒng)中藥，屬補虛藥中補氣藥，其有效成分有黃芪總黃酮、黃芪總皂甙、黃芪總多糖和膽堿等。近年來研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有清除機體氧自由基代謝產(chǎn)物、改善記憶和保護大腦的作用。黃芪的有效成分黃芪總酮和黃芪總甙具有清除氧自由基和調(diào)控NO的作用，可防止生物膜的脂質(zhì)過氧化，其中黃芪總酮的作用最為明顯，是黃芪抗脂質(zhì)過氧化的主要活性成分。在臨床及科研上作用廣泛，這與其藥理作用有著密切的聯(lián)系，而視網(wǎng)膜缺血再灌注由于自由基造成生物膜損傷，特別是線粒體腫脹，可致酶活性降低，氧化磷酸化受到抑制，能量產(chǎn)生障礙，進而使微粒體的多聚核蛋白體解聚脫落，抑制蛋白合成，溶解膜體受損［8］。黃芪中的主要成分黃芪多糖通過提高血中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽-過氧化物酶活力，來提高抗氧化能力。此外黃芪黃酮在體內(nèi)也具有較好的抗氧化作用，相關研究［9］證實黃芪可以明顯減輕視網(wǎng)膜內(nèi)層水腫，可通過平衡鈣離子穩(wěn)態(tài)，減少神經(jīng)型一氧化氮合成酶的激活，使體內(nèi)一氧化氮的生成減少，調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化反應等，從而對RIRI后損傷具有保護作用。黃芪也可使神經(jīng)節(jié)細胞中B-淋巴細胞瘤-2表達增強，B-淋巴細胞瘤-2家族成員之一Bax表達減弱，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡對RIRI起到保護作用［10］。本研究結(jié)果顯示，大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后缺氧誘導因子-1α在再灌注后6 h表達開始出現(xiàn)，在24h表達最強，之后開始下降。在RIRI后12h VEGF的表達開始增加并逐漸增強，再灌注損傷后48h達到峰值，之后開始下降。缺血再灌注組中HIF-1α和VEGF的表達明顯高于正常組，黃芪組視網(wǎng)膜HIF-1α 和VEGF的表達明顯低于缺血再灌注組，實驗結(jié)果提示中藥黃芪可以通過抑制RIRI中HIF-1α及VEGF的表達而發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護性作用，這可能和視網(wǎng)膜組織缺血缺氧時自由基大量產(chǎn)生，自由基與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的反應將造成多種生物膜損傷有關，誘導HIF-1α表達增加主要通過抑制HIF-1α降解途徑，并非增加HIF-1α mRNA翻譯，VEGF促進血管內(nèi)皮細胞的分裂、移行，增加血管的通透性，使組織產(chǎn)生新生血管來緩解組織缺血缺氧。

本研究表明，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展可能與HIF-1α通過上調(diào)VEGF蛋白表達相關聯(lián)，黃芪可以通過抑制缺血視網(wǎng)膜組織中HIF-1α及VEGF的表達而對其起保護作用，但關于黃芪對HIF-1α及VEGF的具體細胞分子途徑目前尚不完全清楚，有待進一步研究。

［1］賈茜鈺，劉勤.中藥提取成分對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷防治作用的研究進展［J］.國際眼科雜志，2015；15（5）:810-812.

［2］仝欣，黃芪主要活性成分的藥理作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）1246-1248.

［3］Semenza GL.Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor 1［J］.Physiology 2009，24（2）:97-106.

［4］Dong A，Xie B，Shen J，et al.Oxidative stress promotes ocular neovascularization［J］.J Cell Physiol，2009，219（3）:544-552.

［5］Fang J，Xia C，Zongxian C，et al.Apigene inhibits VEGF and HIF-1 expression via P13k/AKT/p70s6k1 and HDM2/p53 pathway［J］.Faseb J，2015，19（3）:342-353.

［6］Dan Yi Wang，Arjun Ray，Kathryn Rodgers，et al.Global gene ex-pression changes in rat retinal ganglion cells in experimental glau-coma［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51（8）:4084-4095.

［7］Lando D，Gorman JJ，Whitelaw ML，et al.Oxygen-dependentRegulation of Hypoxia-inducible Factors by Prolyl and Aspar-aginyl Hydroxylation［J］.Eur JBiochem，2003，270（5）:781-790.

［8］Huan Y，Sun SY，Li J.Effect of ERG in rats at simulated plateauhypoxia environment［J］.Int J Ophthalmol，2011，11（10）:1713-1715.

［9］趙奎卿，賀經(jīng).黃芪對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的影響［J］.國際眼科雜志，2006，6（1）:1042-1044.

［10］高峰麗，戚雪.黃芪對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中Bcl-2和Bax表達的影響［J］.國際眼科雜志，2012，12（5）:826-828.

A

1004-2725（2016）02-0105-04

730000甘肅 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院（賈茜鈺、董文）；730000甘肅 蘭州，甘肅省人民醫(yī)院眼科（劉勤、白慧玲）

劉勤，E-mail：summliu@126.com