林伊鳳　王慧君　吳冰冰　楊　琳　董　辰　盧宇藍　周文浩

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·論著·

基于單中心兒童樣本庫人群全外顯子組數(shù)據(jù)的致病突變攜帶者分析

林伊鳳1王慧君2吳冰冰2楊琳2董辰2盧宇藍2周文浩3

目的通過對比公共數(shù)據(jù)庫和復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院分子診斷中心(復(fù)旦兒科)樣本庫全外顯子組測序(WES)數(shù)據(jù)中已知兒童致病突變頻率差異，推測中國人群隱性遺傳致病基因攜帶者頻率分布。方法整理公共數(shù)據(jù)庫(OMIM、ClinVar、HGMD)中常染色體隱性遺傳病的致病基因和突變位點，計算復(fù)旦兒科樣本庫中的WES數(shù)據(jù)，基于公共數(shù)據(jù)庫的致病基因的攜帶者頻率。結(jié)果從公共數(shù)據(jù)庫分析中共得到1 368個常染色體隱性致病基因上的60 209個位點。在復(fù)旦兒科1 147例臨床WES樣本中，共篩出408個基因上的1 016個突變位點。比較復(fù)旦兒科、人類外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(ExAC)東亞(4 312例)和歐洲人群(33 301例)突變位點的出現(xiàn)頻率，3個人群中均發(fā)現(xiàn)了人群特有的突變位點，相比ExAC歐洲人群，復(fù)旦兒科人群中的突變位點出現(xiàn)頻率與ExAC東亞人群更為相近。在攜帶者頻率>1%的基因中，復(fù)旦兒科和ExAC東亞人群相同的基因分別為70/81個(86.4%)和70/102個(68.6%)；復(fù)旦兒科和ExAC歐洲人群相同的基因分別為37/81個(45.7%)和37/136個(27.2%)。結(jié)論通過與ExAC東亞和歐洲人群數(shù)據(jù)進行對比，中國人群中隱性致病基因及致病突變位點的攜帶者頻率與ExAC東亞人群較為相似，與歐洲人群差異較大，建立針對中國人群特異性的常見遺傳攜帶者突變位點篩查項目十分必要。

全外顯子組測序；遺傳??；攜帶者；突變篩查

AbstractObjectiveBy comparing genotype frequencies among public population databases and single pediatric center, the carrier frequency of autosomal recessive disease-causing genes was acquired in Translational Medicine Center of Children′s Hospital of Fudan University (TMCCHFU). These carrier frequencies could be used as a reference to estimate the Chinese population carrier frequency, and would provide essential information for the design of Chinese-specific disease-causing gene carrier screen panel.MethodsThe disease-causing autosomal recessive genes from OMIM, and known pathogenic disease-causing mutations from ClinVar and HGMD were summarized. The carrier frequency of disease-causing genes was calculated using local population data and public population databases seperately, and then compared with each other in further studies.ResultsThe public database were filtered and 60 209 pathogenic mutations on 1 368 autosomal recessive disease-causing genes were found, and 1 016 of mutations on 408 genes were identified in 1 147 WES datasets from TMCCHFU. Compared with ExAC East Asian population (4 312 samples) and ExAC European population (33 301 samples), population-specific mutations were identified in each of the populations. Carrier frequencies in TMCCHFU showed more similarity with ExAC East Asian population than European population. Among genes with carrier frequency higher than 1%, 70 out of 81 genes (86.4%) from TMCCHFU overlapped with 70 out of 102 genes (68.6%) from ExAC East Asian population, while 37 out of 81 genes (45.7%) overlapped with 37 out of 136 genes (27.2%) from ExAC European population.ConclusionThrough comparison with ExAC East Asian and European population, carrier frequency of disease-causing genes identified in TMCCHFU is much more similar with East Asian population than European population. The difference of carrier frequency among populations should not be ignored and makes it necessary to establish a Chinese-specific panel for genetic disease screen.

雖然單個常染色體隱性遺傳病的發(fā)病率不高，但各種遺傳病的群體加和依然數(shù)量驚人，其比例可占嬰兒死亡的20%和兒童住院的10%[1]。攜帶者篩查是針對這類高危人群(如已育患兒的雙親)進行的檢測，目的是幫助雙親了解其攜帶的患某種遺傳病的有害隱性致病基因情況。據(jù)估計，健康人群中平均每人攜帶2.8個先天性隱性遺傳病的致病基因[2]。針對發(fā)生頻率較高、具有人群特異性的遺傳突變，建立有特異性的篩查基因譜，可對攜帶者人群進行疾病預(yù)警和早期診斷。目前，中國攜帶者篩查僅局限于特定基因的單一篩查，如耳聾[3]和脊髓性肌萎縮癥(SMA)[4,5]等。尚無基于大規(guī)模中國人群的常染色體隱性遺傳病人群攜帶頻率的數(shù)據(jù)，更未見采用高通量測序進行攜帶者人群篩查的報道。對于無疾病家族史和生育記錄人群的攜帶者篩查，只能參考國外現(xiàn)有的臨床篩查項目。圖1顯示，對比人類外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(ExAC)中東亞和歐洲人群，目前已知的常染色體隱性致病突變頻率在東亞和歐洲人群間具有較強的特異性，中國人群在上述目前已知的常染色體隱性致病突變頻率是否也具有特異性？

圖1已知致病突變的人群頻率在ExAC東亞和歐洲人群中差別

注橫坐標軸上的點(縱坐標頻率為0)表示該基因中的致病突變在歐洲人群中未檢測到；縱坐標軸上的點(橫坐標頻率為0)表示該基因中的致病突變在東亞人群中未檢測到

1　方法

1.1研究設(shè)計整理公共數(shù)據(jù)庫[人類基因和遺傳病的知識庫(OMIM)、ClinVar、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)]中常染色體隱性遺傳病的致病基因和致病突變位點，計算復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院分子診斷中心(復(fù)旦兒科)樣本庫中的全外顯子組測序(WES)數(shù)據(jù)，基于公共數(shù)據(jù)庫的致病基因的攜帶者頻率，與公共數(shù)據(jù)庫進行對比，分析中國人群隱性遺傳病致病基因攜帶者頻率分布。

1.2已知常染色體隱性突變位點數(shù)據(jù)來源常染色體隱性遺傳病的致病基因注釋來源于OMIM。已知的致病突變位點來源于英國的HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和美國ClinVar數(shù)據(jù)庫(http//:www.nlm.nih.gov/clinvar)。HGMD數(shù)據(jù)庫僅選取分類為致病突變的位點，作為致病置信度等級最高的突變位點；ClinVar數(shù)據(jù)庫挑選注釋為致病性的位點，作為致病置信度等級中等的突變位點。過濾數(shù)據(jù)庫中報道的可能性較高的假陽性位點(如ExAC總體數(shù)據(jù)中≥2次純合變異報道的位點、復(fù)雜疾病的相關(guān)位點等)。正常參照人群數(shù)據(jù)采用ExAC(http://biorxiv.org/content/early/2015/10/30/030338)。

1.3復(fù)旦兒科隱性突變位點數(shù)據(jù)來源復(fù)旦兒科樣本庫中國漢族人群行WES檢測到得的數(shù)據(jù)，所有送檢行WES的病例為臨床送檢病例，送檢時均獲得家屬知情同意。

1.4WES基因組DNA用NanoDrop紫外光分光度儀(美國Thermofisher公司)測定樣本的濃度及定量。參照SureSelct Human All Exon試劑盒說明書，基因組DNA經(jīng)超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接和雜交捕獲。捕獲文庫采用Illumina HiSeq2000平臺，行WES檢測。

1.5測序數(shù)據(jù)初步分析原始圖像文件經(jīng)Illumina base calling 軟件1.7進行圖像識別，去除污染及接頭序列處理后，Clean reads采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件v.0.5.9-r16，以人類基因組hg19(GRCh37)為參考序列進行比對。采用SAMtools軟件v.0.1.16，對生成的BAM文件進行排序、合并和去除重復(fù)。生成初步分析數(shù)據(jù)，包括：reads長度分析、數(shù)量及總產(chǎn)量、reads比對到參考序列的總序列在基因組中的覆蓋度與測序深度等。采用GATK軟件 v.3.2.2進行SNV分析。排除低可信度SNPs：①測序深度<4，②一致性質(zhì)量評分<20，③鄰近區(qū)域平均拷貝數(shù)>2，④與前1個SNV距離<5 bp。

1.6復(fù)旦兒科WES樣本中突變位點的篩選在保證HGMD已報道位點的前提下，先篩除位于外顯子捕獲區(qū)域外的內(nèi)含子突變，其次篩除公共數(shù)據(jù)庫中具有較高純合頻率的位點。余下的位點用于后續(xù)的對比分析。

1.7攜帶者頻率算法設(shè)基因G上存在n個可能發(fā)生的已知致病突變位點，其突變發(fā)生的頻率相互獨立，分別為p1,p2...pn。

同時假設(shè)，這些突變中的任何一個都能使基因G失活，而基因G的2個等位基因同時失活導(dǎo)致疾病的發(fā)生，則：

2　結(jié)果

2.2復(fù)旦兒科WES數(shù)據(jù)中致病突變位點的攜帶者頻率評估復(fù)旦兒科樣本建庫以來對1 147例臨床樣本行WES，共檢出1 016個上述公共數(shù)據(jù)庫中篩選后的致病突變位點。在復(fù)旦兒科、ExAC東亞人群(4 312例)和歐洲人群(33 301例)之間比較突變位點的出現(xiàn)頻率，圖2中的每個點代表1個突變，橫坐標軸上點(縱坐標頻率為0)分別為東亞和歐洲人群特有的致病突變位點，縱坐標軸上點(橫坐標頻率為0)為復(fù)旦兒科人群檢測到的特有致病突變位點，未處于坐標軸上的點越接近對角線，則表示突變頻率在ExAC相應(yīng)人群和復(fù)旦兒科人群間越相似。對比圖2可見，復(fù)旦兒科人群致病突變位點的出現(xiàn)頻率與ExAC東亞和歐洲人群均存在差異，3個人群中均發(fā)現(xiàn)了人群特有的突變位點。相比于ExAC歐洲人群，復(fù)旦兒科人群中的致病突變位點出現(xiàn)頻率與ExAC東亞人群更為相近，符合本文對于突變位點人群特異性的假設(shè)。

圖2已知致病突變的人群頻率在復(fù)旦兒科人群和ExAC東亞和歐洲人群中的差別

注坐標軸上的點表示該基因中的致病突變在相應(yīng)人群數(shù)據(jù)庫中未檢測到；由于3個人群的樣本量存在差異(復(fù)旦兒科1 147例，ExAC東亞人群4 312例，歐洲人群33 301例)，故突變頻率的最小值存在差異

2.3致病基因的攜帶者頻率評估圖3A為復(fù)旦兒科人群中攜帶者頻率>1%的基因(81個)做降序排列，圖3B截取了ExAC東亞人群攜帶者頻率>1%的102個基因中的前81個基因做降序排列，圖3C截取了ExAC歐洲人群攜帶者頻率>1%的136個基因中的前81個基因做降序排列。

按照攜帶者頻率計算公式計算致病基因的攜帶者頻率，復(fù)旦兒科人群1 016個致病突變位點，涉及413個基因，攜帶者頻率最高的是USH2A基因，該基因在復(fù)旦兒科人群中共檢測到24個致病突變，據(jù)此估算出的基因攜帶者頻率為16.8%；9個基因的攜帶者頻率>5%，包括USH2A、PCDH15、CFTR、DYSF、NPHS1、TG、WNT10A、ABCA4和PAH，分別為Usher綜合征、囊性纖維化(CF)、肌萎縮、腎病綜合征、甲狀腺功能減低癥、外胚層發(fā)育不良、斯特格氏病和苯丙酮尿癥的致病基因。②東亞人群中攜帶者頻率>5%的有12個基因(圖3B)，依次為USH2A、CFTR、PCDH15、DYSF、SLC25A13、MYO7A、CEP290、NPHS1、ITGB3、TG、CD36和WFS1；③歐洲人群中攜帶者頻率>5%有7個基因(圖3C)，依次為CFTR、ABCA4、MYO7A、CYP21A2、RYR1、VWF和CEP290。

在攜帶者頻率>1%的基因中，復(fù)旦兒科和ExAC東亞人群相同的基因分別為70/81個(86.4%)和70/102個(68.6%)；在攜帶者頻率>1%的基因中，復(fù)旦兒科和ExAC歐洲人群相同的基因分別為37/81個(45.7%)和37/136個(27.2%)。

在攜帶者頻率>5%的基因中，復(fù)旦兒科和ExAC東亞人群相同的基因分別為6/9個(66.7%)和6/12個(50.0%)，且前4位基因(USH2A、PCDH15、CFTR、DYSF)相同，排序略有不同；在攜帶者頻率>5%的基因中，復(fù)旦兒科和ExAC歐洲人群相同的基因分別為2/9個(22.2%)和

圖3按不同人群攜帶者頻率排序的隱性遺傳致病基因(部分)

注基因分別按復(fù)旦兒科(A)、ExAC東亞人群(B)及歐洲人群(C)中的攜帶者頻率降序排列，縱坐標為基因攜帶者頻率的自然對數(shù)值

2/7個(28.6%)。復(fù)旦兒科和ExAC歐洲人群不相同的7個基因中有5 個基因(USH2A、PCDH15、DXSF、NPHS、TG)出現(xiàn)在東亞人群。

3　討論

本研究對公共數(shù)據(jù)庫ExAC東亞、歐洲及復(fù)旦兒科的WES數(shù)據(jù)進行攜帶者頻率分析，在復(fù)旦兒科人群發(fā)現(xiàn)了413個基因上的1 016個文獻報道致病突變位點，其中81個致病基因的人群攜帶者頻率>1%。人群間對比發(fā)現(xiàn)，攜帶者頻率存在明顯的人群差異，但復(fù)旦兒科與東亞人群的一致性遠高于歐洲人群。對于頻率較高(以5%或1%為界)、具有人群篩查價值的基因而言，復(fù)旦兒科和東亞人群的基因攜帶者頻率一致性更好。以攜帶者頻率>1%的基因為例，在歐洲人群中攜帶者頻率>1%的基因僅有45.7%在復(fù)旦兒科人群中也>1%，而東亞人群中攜帶者頻率>1%的基因有86.4%在復(fù)旦兒科人群也>1%，這一特異性也與致病突變在人群間的差異一致。

根據(jù)本文結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，USH2A、CFTR、PCDH15、DYSF等基因在ExAC東亞和復(fù)旦兒科人群都有著較高的攜帶者頻率。但也有一些基因在東亞人群表現(xiàn)的攜帶者頻率比復(fù)旦兒科人群高，比如MYO7A、CD36、SLC25A13、CEP290和ITGB3。頻率差別的主要原因有2種，MYO7A和CD36在ExAC東亞人群中檢出了更多的致病突變數(shù)量；SLC25A13和ITGB3在致病熱點上有顯著的差異；CEP290則2種原因皆有。

CFTR基因在復(fù)旦兒科、ExAC東亞或歐洲人群中都有很高的攜帶者頻率，且在東亞和歐洲人群中的攜帶率較復(fù)旦兒科人群高。該基因突變會導(dǎo)致CF，被認為是歐美常見，亞洲及中國罕見的遺傳病。劉亭威等[6]復(fù)習(xí)文獻檢索到26例中國CF患者，臨床表現(xiàn)與歐美人群相似，但CFTR基因突變位點可能與白種人不同。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，中國CF患者的CFTR基因突變類型與西方有很大差異。本研究中，CFTR基因在ExAC東亞和復(fù)旦兒科人群攜帶率高，但發(fā)病率低，可能是由于在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)的致病突變在亞洲人群中表現(xiàn)出的癥狀較輕或無癥狀。因此，單純使用歐美CFTR常見突變進行篩查不能反映中國人群的CFTR基因突變攜帶情況，應(yīng)結(jié)合中國實際人群的突變攜帶位點設(shè)計篩查項目。

Usher綜合征以不同程度的視網(wǎng)膜色素變性和感音神經(jīng)性耳聾為主要表現(xiàn)，致病基因為USH2A、PCDH15、MYO7A等。美國的Usher綜合征發(fā)病率為(1～4)/25 000[8,9]，國內(nèi)尚無發(fā)病率數(shù)據(jù)。本研究復(fù)旦兒科人群Usher綜合征致病基因的攜帶者頻率較高，但依然與東亞人群的攜帶者頻率相一致。推測，HGMD中報道的歐洲人群的致病位點有可能在亞洲人群中表現(xiàn)為不致病的熱點突變。進一步分析，在USH2A基因中，如c.5953G>A, c.10246T>G, c.4758+3A>G等多個突變位點在ExAC東亞人群(約4 000人)中出現(xiàn)10～140次，而在歐洲人群(約30 000人)中出現(xiàn)均<10次，同時這些位點在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中的亞洲人群的頻率在1%左右，而歐洲人群的頻率卻為0，說明存在具有很強人群特異性的致病突變位點。參考以往研究發(fā)現(xiàn)中國人群與歐美人群USH2A基因致病的突變譜有著很大的差異[10]，證明Usher綜合征相關(guān)基因突變位點的致病性可能存在人群特異性，說明現(xiàn)有文獻報道的致病突變在應(yīng)用于其他人群時，突變位點的致病性還有待商榷。這也可以解釋Usher綜合征在ExAC東亞和復(fù)旦兒科人群均出現(xiàn)的致病基因攜帶者頻率高，但發(fā)病率低的情況。

除此之外，本研究呈現(xiàn)的大部分內(nèi)容能夠很好的反映臨床情況。如TG基因突變導(dǎo)致的先天性甲狀腺功能減低癥在中國的發(fā)病率為49.2/100 000[11]，而該病在歐美人群的發(fā)病率為28/100 000[12]，本研究結(jié)果也同樣顯示復(fù)旦兒科人群的TG突變頻率高于歐洲人群。亞洲人高發(fā)的Citrin缺乏病的致病基因SLC25A13，在東亞和復(fù)旦兒科人群的攜帶者頻率遠高于歐洲人群。這與該病主要在東亞地區(qū)分布[13]，在中國遺傳代謝疾病譜中排第2位的情況也相符合[14]。而與線粒體DNA質(zhì)量相關(guān)的POLG基因突變，會導(dǎo)致Alpers-Huttenlocher綜合征、遺傳性進行性眼外肌麻痹等一系列疾病，則表現(xiàn)為歐美人群發(fā)病率高于亞洲人群，這與本研究的歐洲人群攜帶者頻率高于東亞及復(fù)旦兒科人群也是相一致的。再如PCCA基因突變會導(dǎo)致丙酸血癥，本研究結(jié)果中該基因的攜帶者頻率在復(fù)旦兒科和東亞人群中約為3%，而歐洲人群中則<1%。既往并未報道丙酸血癥的發(fā)病率有明顯的人群差異，但丙酸血癥的致病基因除了PCCA外還有PCCB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCCB基因的攜帶者頻率在歐洲人群中約為2%，而東亞和復(fù)旦兒科人群中則<1%。該數(shù)據(jù)體現(xiàn)了丙酸血癥在人群致病基因的特異性。

雖然復(fù)旦兒科人群攜帶者頻率與ExAC東亞人群較為吻合，但是由于本研究的研究對象是臨床送檢的樣本，并非健康的人群，仍存在樣本選擇的偏倚，可能導(dǎo)致與中國人群實際頻率存在偏差。如IL10-RA基因在復(fù)旦兒科的攜帶者頻率較東亞人群及歐洲人群均高出許多，原因在于復(fù)旦兒科的樣本中有1例先天性免疫缺陷的患兒，由于IL10-RA基因隱性突變所致，而該患兒的2個隱性突變分別來自其雙親，所以該家系使得在本研究中IL10-RA基因的攜帶者頻率顯著增高。除此之外，本研究僅針對常染色體隱性遺傳疾病致病基因中點突變的形式進行攜帶者頻率計算，并不包括基因的大片段缺失的攜帶者頻率。所以本研究中的攜帶者頻率較高的基因并沒有包含某些發(fā)病率高、因大片段缺失或者拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的疾病，如地中海貧血[15]和SMA[5]。

攜帶者篩查能有效降低常染色體隱性疾病的發(fā)病率。在以色列針對CF的人群攜帶者篩查已經(jīng)取得成效，一項回顧性研究顯示，CF發(fā)病率已經(jīng)從1990年的14.5/10萬降至2011年的6/10萬[16]。中國僅對于嚴重的常染色體隱性遺傳病，如地中海貧血、X連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、SMA等開展了單個疾病的攜帶者篩查，對于其他常見遺傳攜帶者突變位點，仍需建立新的攜帶者篩查項目，以明確中國人群致病突變的攜帶率。當然，不是所有的隱性遺傳性疾病都適合進行篩查和產(chǎn)前診斷，對于一些外顯不全的致病基因，或臨床危害不嚴重的疾病如色盲，則并不建議進行遺傳篩查和家庭遺傳咨詢[17]。目前，高通量測序成本的降低，使大規(guī)模的遺傳篩查成為可能[18,19]。而隨著生殖技術(shù)的發(fā)展，基因測序在臨床的應(yīng)用，除了熟知的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測外，還有胚胎植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)。這些技術(shù)的應(yīng)用，真正使基因檢測的結(jié)果服務(wù)于臨床，使患者家庭受益，也推動了基因篩查的普及和應(yīng)用。

本研究通過大規(guī)模對比文獻報道的致病突變位點在不同人群間的頻率差異，明確了致病突變位點在不同人群中具有很大的差異性。在此基礎(chǔ)上計算的致病基因攜帶者頻率，也表現(xiàn)出人群特征。因此，若要建立中國人群常見遺傳攜帶者突變位點篩查項目，有必要針對致病突變的人群差異對篩選內(nèi)容做出調(diào)整，通過參考中國人群的致病突變頻率設(shè)計高通量的基因篩查方案，為包括有生育需求的成年人、已計劃懷孕的夫婦，尤其是對已生育患兒的家庭再計劃懷孕的高危人群提供攜帶者篩查，或是為家庭遺傳咨詢提供依據(jù)。

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(本文編輯：張崇凡)

Carrier analysis of known disease-causing genes based on WES data from single Shanghai pediatric center

LINYi-feng1,WANGHui-jun2,WUBing-bing2,YANGLin2,DONGChen2,LUYu-lan2,ZHOUWen-hao3

(1InstituteofPediatrics, 2MolecularDiagnosticCenter, 3DepartmentofNeonatology,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China)

LU Yu-lan，E-mail:yulanlu@fudan.edu.cn

Whole exome sequencing;Genetic disease;Carrier;Mutation screening

2016上海市青年科技英才揚帆計劃:16YF1401000; 2016上海自然科學(xué)基金探索類項目:16ZR1446500

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院1 兒科研究所，2 分子診斷中心，3 新生兒科上海，201102

盧宇藍，E-mail:yulanlu@fudan.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.03.009

2016-02-23

2016-06-08)