張瓊麗，羅文鴻，林哲絢（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515041）

甘露醇誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用

張瓊麗，羅文鴻，林哲絢
（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515041）

目的 觀察甘露醇是否通過引起人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）的氧化應(yīng)激反應(yīng)而損傷細(xì)胞。方法MTT法檢測(cè)不同濃度甘露醇（50，100，150，200，250，300，350和400 mmol·L-1）處理HK-2細(xì)胞4，10，24，48和72 h對(duì)細(xì)胞活性的影響；甘露醇100和250 mmol·L-1作用細(xì)胞4～72 h，DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)MDA含量、SOD活性和GSH含量。結(jié)果 甘露醇250 mmol·L-1作用72 h，細(xì)胞增殖活性約為溶劑對(duì)照組的50%（P＜0.05）；孵育4 h，細(xì)胞ROS的熒光強(qiáng)度（68.7±3.6）顯著高于溶劑對(duì)照組（50.3±4.6）（P＜0.05）；孵育4～72 h，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、空泡化，細(xì)胞脫落；細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增高（P＜0.05），SOD活性和GSH含量明顯下降（P＜0.05）。孵育4 h時(shí)，溶劑對(duì)照組和甘露醇250 mmol·L-1處理組細(xì)胞內(nèi)MDA含量分別為（3.1±1.6）和（20.9±5.7）μmol·g-1蛋白，SOD活性分別為（71.8±6.5）和（47.3±8.8）kU·g-1蛋白，GSH含量分別為（60.8±2.3）和（13.6±3.3）μmol·g-1蛋白。甘露醇100 mmol·L-1處理組GSH含量顯著降低（P＜0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)變化不明顯。結(jié)論 高濃度（250 mmol·L-1）甘露醇可能通過氧化應(yīng)激途徑損傷腎小管上皮細(xì)胞而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。

甘露醇；腎小管；上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；丙二醛

臨床上，甘露醇（mannitol）作為滲透性利尿劑，廣泛應(yīng)用于組織脫水（如腦水腫）和降低眼內(nèi)壓、顱內(nèi)高壓等。但近年來的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，一些患者在大劑量、長(zhǎng)時(shí)間給藥后易出現(xiàn)某種程度的腎損傷或腎毒性。已有報(bào)道，甘露醇有引發(fā)急性腎功能衰竭（acute renal failure，ARF）的毒性作用［1-2］。實(shí)驗(yàn)研究表明，動(dòng)物靜脈注射甘露醇后，可使腎近端小管上皮細(xì)胞廣泛空泡變性；超微結(jié)構(gòu)顯示，胞漿內(nèi)高密度胞漿體數(shù)目減少；大劑量較長(zhǎng)時(shí)間使用甘露醇可致動(dòng)物死亡或誘發(fā)出現(xiàn)ARF并急性腎小管損傷［3-5］。近年來，氧自由基對(duì)腎的損傷作用已引起廣泛關(guān)注，在各種腎病中可見腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷，包括移植腎缺血再灌注損傷和腎中毒等［6-7］，而這些均可誘導(dǎo)引起ARF。本研究采用體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞），研究甘露醇對(duì)其毒性損傷作用的機(jī)制，探討甘露醇對(duì)腎組織及腎細(xì)胞的損傷類型是否與氧化應(yīng)激有關(guān)。

1　材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器

甘露醇，購(gòu)自阿拉丁試劑公司；DMEM/F12 （1∶1）培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；新生牛血清，杭州四季青公司；BCA蛋白定量試劑盒，中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；MTT和2′，7′-二氯熒光-二乙酸酯（DCFH-DA），美國(guó)Sigma公司；Triton-X 100和胰蛋白酶（1∶250），美國(guó)Amresco公司；DMSO和EDTA，上海生物工程有限公司；牛血清白蛋白，上海吉泰科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所。SW-CJ-ZF超凈工作操作臺(tái)，AIR TECH蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TMS倒置生物顯微鏡，日本Nikon公司；371-184LCO2培養(yǎng)箱，Multiskan酶標(biāo)儀，美國(guó)ThemoForma公司；GEMINI XS紫外/熒光掃描酶標(biāo)儀，美國(guó)SPECTRA MAX公司；PB602-E型精密天平，德國(guó)Sartorius公司；Centrifuge 5804R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；DKS-12電熱恒溫水浴裝置，上海中興醫(yī)療儀器廠。

1.2HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。在37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的條件下，HK-2細(xì)胞接種于含有10%新生牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基中，每2～3 d換液1次，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用含有0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代或接種。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞按每孔5×103細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)24 h貼壁后，換以含不同濃度甘露醇（50，100，150，200，250，300，350 和400 mmol·L-1）的培養(yǎng)基分別孵育細(xì)胞4，10，24，48和72 h，以等體積溶劑作為陰性對(duì)照組，每組設(shè)4～5復(fù)孔。孵育結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT （5 g·L-1）溶液，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 200 μL溶解結(jié)晶，避光低速搖勻10 min后，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光值（A490 nm）。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。處理組細(xì)胞存活率（%）＝處理組（A490 nm）/對(duì)照組（A490 nm）×100%。

1.4DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞的活性氧水平

將HK-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，用不同濃度甘露醇（100和250 mmol·L-1）孵育細(xì)胞4 h，用PBS洗3次后，20 μmol·L-1DCFH-DA熒光染料孵育細(xì)胞30 min，PBS洗3次后，各孔加入0.1% Triton X-100（V/V）500 μL，搖床裂解10 min，收集裂解液。用熒光掃描酶標(biāo)儀在485 nm激發(fā)波長(zhǎng)和530 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度?；钚匝跛脚c熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

1.5氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

將HK-2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，用含不同濃度甘露醇（100和250 mmol·L-1）的培養(yǎng)基分別孵育細(xì)胞4，10，24，48和72 h，以等體積溶劑作為陰性對(duì)照組，倒置顯微鏡下拍照觀察，記錄細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)和濃度下的細(xì)胞形態(tài)變化。孵育結(jié)束后，PBS洗3次，用細(xì)胞刮鏟收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，800×g離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，制成懸液。按MDA，SOD和GSH檢測(cè)試劑盒說明書的方法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)和分析，每組設(shè)3復(fù)孔。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1甘露醇對(duì)HK-2細(xì)胞存活的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，甘露醇對(duì)HK-2細(xì)胞有明顯毒性作用，且4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均隨藥物濃度增加細(xì)胞存活率降低，呈濃度依賴性（4 h，r2=0.89，P＜0.01；10 h，r2=0.91，P＜0.01；24 h，r2=0.90，P＜0.01；48 h，r2=0.92，P＜0.01；72 h，r2=0.94，P＜0.01）。甘露醇＜100 mmol·L-1孵育72 h對(duì)HK-2細(xì)胞存活無顯著影響；甘露醇150 mmol·L-1孵育＞24 h或＞200 mmol·L-1孵育＞4 h可顯著降低細(xì)胞存活率（P＜0.05）；甘露醇250 mmol·L-1孵育72 h，細(xì)胞存活率約為溶劑對(duì)照組的50%（圖1）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響的甘露醇濃度100 mmol·L-1和對(duì)細(xì)胞損傷約50%的250 mmol·L-1進(jìn)行。

Fig.1 Effect of mannitol on HK-2 cell viability.HK-2 cell viability was detected with MTT assay.Cell viability（%）=A490 nmof mannitol treated group/A490 nmof solvent control group×100%.，n=4.*P＜0.05，compared with solvent control（0 mmol·L-1）group.

2.2甘露醇對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響

用甘露醇100和250 mmol·L-1分別孵育HK-2細(xì)胞4，10，24，48和72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。甘露醇100 mmol·L-1與HK-2細(xì)胞孵育4，10，24，48和72 h，細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞無明顯區(qū)別，形態(tài)正常；但甘露醇250 mmol·L-1處理后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞腫脹、空泡化，細(xì)胞脫落。圖2為甘露醇孵育72 h細(xì)胞形態(tài)的變化。

Fig.2 Morphological changes of HK-2 cells after treatment with mannitol for 72 h（×40）. ：cell swelling；：cell vacuoles or fall off.

2.3甘露醇對(duì)HK-2細(xì)胞活性氧水平的影響

與溶劑對(duì)照組（熒光強(qiáng)度50.3±4.6）相比，甘露醇100和250 mmol·L-1作用細(xì)胞4 h熒光強(qiáng)度分別為59.8±3.0和68.7±3.6，表明細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高（n=3，P＜0.05）。甘露醇250 mmol·L-1使細(xì)胞內(nèi)活性氧增加的幅度約為100 mmol·L-1的2倍（n=3，P＜0.05）。

2.4甘露醇對(duì)HK-2細(xì)胞MDA和GSH含量及SOD活性的影響

與溶劑對(duì)照組相比，甘露醇100 mmol·L-1作用細(xì)胞4，10，24，48和72 h后，細(xì)胞MDA含量和SOD活性無顯著改變（圖3A，3B），GSH含量顯著降低（P＜0.05）（圖3C）；甘露醇250 mmol·L-1作用4～72 h細(xì)胞MDA含量顯著增高，約為溶劑對(duì)照組的6倍，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低50%左右，GSH含量減少70%～80%（圖3）。

Fig.3 Effect of mannitol on malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH）content and superoxide dismutase （SOD）activity in HK-2 cells.，n=3.A：MDA content；B：SOD activity；C：GSH content.*P＜0.05，compared with solvent control（0 mmol·L-1）group.

3　討論

目前，甘露醇引起ARF的機(jī)制尚不明確，臨床認(rèn)為甘露醇可能通過升高血液滲透壓使之超過腎小球?yàn)V過壓，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過降低或停止而發(fā)生腎損害。在臨床上，甘露醇成人的常規(guī)劑量是1～2g·kg-1，按成人體質(zhì)量60 kg，血容量70 mL·kg-1計(jì)算，1.35 g·kg-1的給藥劑量約為100 mmol·L-1的血藥濃度。據(jù)報(bào)道，甘露醇大劑量、長(zhǎng)時(shí)間給藥，如200 g·d-1持續(xù)4 d（共800 g），或在甘露醇總給藥劑量600 g時(shí)，已出現(xiàn)ARF和腎損傷的不良反應(yīng)，而此時(shí)的劑量約為常規(guī)劑量的2.5倍，即250 mmol·L-1。所以在臨床上，治療一般的組織脫水，常規(guī)給藥劑量約為100 mmol·L-1的血藥濃度。當(dāng)大劑量給藥時(shí)，如250 mmol·L-1，即有可能出現(xiàn)腎毒性和不同程度腎損傷，這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大致相同。所以本研究選擇了甘露醇常規(guī)濃度100 mmol·L-1和高濃度250 mmol·L-1作用于細(xì)胞，進(jìn)一步研究甘露醇引起ARF或腎損傷的可能機(jī)制。

氧化應(yīng)激代謝中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平可反映細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度；MDA可破壞細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，并可通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性等途徑損傷細(xì)胞?？寡趸到y(tǒng)中包括抗氧化酶和非酶抗氧化劑，主要的抗氧化酶之一是SOD，其可通過清除自由基而減少或消除氧化損傷；非酶抗氧化劑中的GSH也可通過清除自由基中的低分子質(zhì)量物質(zhì)而起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用。所以，本研究選擇這3個(gè)指標(biāo)觀察甘露醇對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，甘露醇250 mmol·L-1作用4 h可引起細(xì)胞內(nèi)活性氧顯著增加，細(xì)胞內(nèi)MDA含量在4～72 h也顯著增加，而同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的SOD活性和GSH含量顯著下降，說明高濃度（250 mmol·L-1）甘露醇可能通過促進(jìn)細(xì)胞活性氧大量產(chǎn)生，使胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物急劇增加，同時(shí)抗氧化系統(tǒng)被破壞，大量MDA的積累可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，從而損傷腎細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。常規(guī)濃度的甘露醇100 mmol·L-1作用4 h也可引起細(xì)胞活性氧的小幅增加，但此時(shí)可能機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)可以阻止活性氧氧化生物膜上的不飽和脂肪酸，而不導(dǎo)致MDA含量的明顯變化。細(xì)胞內(nèi)GSH含量的下降提示細(xì)胞抗氧化防御中可能優(yōu)先消耗GSH抗氧化物質(zhì)，通過清除自由基中的低分子質(zhì)量物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用。張?chǎng)蔚龋?］在研究七葉皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性時(shí)也認(rèn)為GSH作為抗氧化劑可以清除活性氧而減輕細(xì)胞氧化損傷。Baliga等［6］在研究甘油誘導(dǎo)所致ARF時(shí)，腎GSH含量也顯著下降，表明GSH在其中起到重要的保護(hù)作用。

由于機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)能清除外界少量的活性氧而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，常規(guī)濃度的甘露醇可能只使細(xì)胞處于輕度氧化應(yīng)激狀態(tài)，而高濃度的甘露醇則可能通過促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，打破細(xì)胞氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡。因此，高濃度（250 mmol·L-1）甘露醇可能通過氧化應(yīng)激途徑損傷腎小管上皮細(xì)胞而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。

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Effect of mannitol on oxidative stress of human kidney tubular epithelial cells

ZHANG Qiong-li，LUO Wen-hong，LIN Zhe-xuan
（Bioanalytical Laboratory，Medical College of Shantou University，Shantou 515041，China）

OBJECTIVE To observe the effect of mannitol on oxidative stress of human kidney tubular epithelial cells（HK-2）.METHODS MTT assay was applied to detect HK-2 cell viability after exposure to different concentrations（50，100，150，200，250，300，350 and 400 mmol·L-1）of mannitol for 4，10，24，48 and 72 h.DCFH-DA method was used to determine the level of reactive oxygen species （ROS）after HK-2 cells were exposed to mannitol 100 and 250 mmol·L-1for 4 h.Furthermore，cell morphology and indexes of oxidative stress such as malondialdehyde（MDA）content，superoxide dismutase（SOD）activity and glutathione（GSH）content were observed at different time points. RESULTS HK-2 cell viability decreased by about 50%after being treated with mannitol 250 mmol·L-1for 72 h（P＜0.05）.ROS production in mannitol 250 mmol·L-1treated group（68.7±3.6）was higher than in solvent control group（50.3±4.6）（P＜0.05）.HK-2 cells exhibited morphological changes after treatment with mannitol 250 mmol·L-1for 4-72 h，including cell swelling，vacuoles and fall off.After treatment with mannitol 250 mmol·L-1for 4，10，24，48 ahd 72 h，the MDA content increased significantly（P＜0.05），while the activity of SOD and the content of GSH decreased significantly compared with solvent control group（P＜0.05）.CONCLUSION Over-production of ROS in HK-2 cells induced by high concentration（250 mmol·L-1）of mannitol may cause lipid peroxidation and injure the ability of antioxidation，which may contribute to mannitol induced cytotoxicity.

mannitol；renal tubule；epithelial cells；oxidative stress；malondialdehyde

The project supported by Natural Science Foundation of China（81170315）；and Team Research Project of Guangdong Provincial Natural Science Foundation（9351503102000001）

LIN Zhe-xuan，Tel：（0754）8900530，E-mail：g_zxlin@stu.edu.cn

R969.3，R983.1

A

1000-3002（2016）02-0122-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.006

2015-06-15接受日期：2016-01-13）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81170315）；廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（9351507102000-001）

張瓊麗（1988－），碩士研究生，主要從事藥物分析與代謝研究。

林哲絢，E-mail：g_zxlin@stu.edu.cn，Tel：（0754）88900530