李 欣，曹煥玲，趙亞偉，郭銀漢，王慶陽（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0009；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京 00850）

Sdha
Sdha基因敲低對小鼠肝細胞BNL CL.2細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響

李 欣1，曹煥玲2，趙亞偉2，郭銀漢1，王慶陽2
（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京 100850）

目的 探討琥珀酸脫氫酶復(fù)合物亞單位A（SDHA）對小鼠肝細胞BNL CL.2細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響。方法 用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA敲低BNL CL.2細胞中sdha基因的表達。流式細胞儀檢測慢病毒的感染效率；實時熒光定量PCR和Western蛋白印跡法分別檢測sdha mRNA和SDHA蛋白表達水平；細胞計數(shù)法檢測細胞增殖；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期。結(jié)果 無相關(guān)shRNA對照組和sdha shRNA組慢病毒的感染效率均＞80%。與無相關(guān)shRNA對照組相比，感染sdha shRNA慢病毒載體的BNL CL.2細胞sdha mRNA水平降低20倍左右（P＜0.01），蛋白表達水平降低10倍左右（P＜0.01）；細胞增殖速度減慢，為無相關(guān)shRNA對照組的70%左右（P＜0.05）；細胞周期發(fā)生改變，G0/G1期細胞百分率是無相關(guān)shRNA對照組的1.17倍（P＜0.01），G2/M期細胞百分率為1.37倍（P＜0.01），S期細胞百分率為73.8% （P＜0.01）；但細胞凋亡率無明顯差異。結(jié)論 降低SDHA表達對小鼠肝細胞BNL CL.2細胞增殖有明顯的抑制作用，其抑制作用與細胞周期阻滯相關(guān)，與細胞凋亡無明顯關(guān)系。

琥珀酸脫氫酶復(fù)合物亞單位A；BNL CL.2細胞；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

琥珀酸脫氫酶復(fù)合物亞單位A（succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA）是組成異源四聚體琥珀酸脫氫酶的亞基，位于線粒體內(nèi)膜上，參與三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈的電子傳遞，在細胞能量代謝中發(fā)揮重要作用［1］。腫瘤的形成往往跟代謝紊亂有密切關(guān)系。琥珀酸脫氫酶家族成員SDHA，SDHB，SDHC和SDHD均被認(rèn)為能抑制腫瘤發(fā)生［2-5］，早期的研究表明，SDHA基因的突變與一種被稱為雷吉綜合征（Leigh Syndrome）的線粒體呼吸鏈缺陷病有關(guān)［6］。其突變是副神經(jīng)節(jié)瘤以及胃腸道間質(zhì)性腫瘤中的標(biāo)志之一。關(guān)于SDHA的腫瘤抑制作用曾經(jīng)存在爭議，因為在某些腫瘤中SDHA的突變或表達降低不像其他琥珀酸脫氫酶亞基頻繁。近年來，在野生型胃腸間質(zhì)細胞瘤（wildtype GIST）、嗜鉻細胞瘤（Paraganglioma）以及原發(fā)性肝細胞癌中也發(fā)現(xiàn)了SDHA基因的缺陷或表達異常［2，7-8］。2011年，Burnichon［2］在副神經(jīng)節(jié)瘤里發(fā)現(xiàn)SDHA突變，提出SDHA是腫瘤抑制因子的說法。2012年，Italiano等［7］發(fā)現(xiàn)，在非KIT或PDGFRA突變的胃腸道間質(zhì)瘤中，存在與SDHA的功能缺失相關(guān)的基因突變；2014年Shimizu等［8］發(fā)現(xiàn)，56%的肝細胞癌患者肝細胞中存在SDHA表達下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)證實SDHA突變或缺失與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。然而SDHA表達下調(diào)后如何促進腫瘤生成卻鮮見報道。早在20世紀(jì)30年代，研究者們就認(rèn)為細胞代謝模式由有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒獾倪^程是正常細胞向腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的誘因之一［9-10］。有報道認(rèn)為，琥珀酸脫氫酶家族成員發(fā)揮抑瘤效應(yīng)與阻止細胞代謝模式由有氧代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變有關(guān)［11］。該觀點得到一些實驗數(shù)據(jù)的支持，如Guzy等［12］發(fā)現(xiàn)，SDHB表達缺失能夠激活活性氧依賴的HIF-α活化，從而使細胞適應(yīng)低氧環(huán)境而促進腫瘤發(fā)生。然而在這一過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用的是SDHB而非SDHA，提示SDHA通過其他機制發(fā)揮抑瘤效應(yīng)。因此，研究SDHA在正常組織細胞中如何作用對于揭示SDHA在腫瘤組織中表達下調(diào)的機制以及促進細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制具有重要意義。

肝作為人體重要的能量代謝器官，其線粒體功能正常對于維持肝正常的生理功能及肝細胞的生長發(fā)育尤為重要，但SDHA在肝細胞中發(fā)揮什么作用尚未見報道。小鼠胎肝來源的肝細胞BNL CL.2細胞，相對于肝癌細胞，通常作為“非惡性”細胞用來進行肝細胞相關(guān)功能的研究。本研究采用“l(fā)oss of function”的研究思路，以小鼠胎肝來源的細胞BNL CL.2為模型細胞，通過以慢病毒為載體介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)敲低sdha的表達，探討其對BNL CL.2細胞增殖、周期和凋亡的影響，初步揭示sdha缺失對促進腫瘤發(fā)生的作用機制。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑和主要儀器

小鼠肝細胞BNL CL.2細胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子免疫學(xué)研究室保存，在含有10%胎牛血清（蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）中常規(guī)培養(yǎng)。

Sdha shRNA由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成（表1），病毒感染增強劑也由該公司提供；寡核苷酸引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成（表2）；RNA提取試劑Trizol，美國Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒，美國Thermo公司；RIPA裂解液，北京天根生物公司；抗SDHA山羊多克隆抗體，美國Santa Cruze公司；抗β肌動蛋白抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊抗體及山羊抗小鼠抗體，北京中杉金橋公司；Annexin Ⅴ-PE/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒，美國BD Pharmingen公司；細胞周期檢測試劑盒，天津三箭公司；RNA酶A，美國Sigma公司。光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；細胞計數(shù)板，上海化科實驗器材有限公司；紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；7500 Fast Real-time PCR儀及SDS-PAGE蛋白電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；FACS Calibur型流式細胞儀，美國BD公司。

Tab.1 shRNA sequences targeting mouse succinate dehydrogenase complex subunit A（sdha）

Tab.2 Primers for quantitative real-time PCR

1.2細胞分組及慢病毒感染

細胞分為3組，無關(guān)shRNA對照組（sh-control，感染含無關(guān)shRNA序列慢病毒），sdha shRNA慢病毒1（sh-sdha1）和sdha shRNA慢病毒2（shsdha2）組（分別包含靶向sdha不同的核苷酸序列的shRNA）。將BNL CL.2細胞（1×108L-1）以每孔500 μL接種于24孔板中，待細胞密度達70%～80%時，吸出培養(yǎng)基，并用生理鹽水洗1次。將滴度為1×1011TU·L-1的sh-control，sh-sdha1或sh-sdha2 各5 μL分別加入到200 μL病毒感染增強劑中，充分混勻后加入到孔中，將24孔板放入濕盒內(nèi)，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，吸去含病毒的感染增強劑，加入500 μL DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3流式細胞儀檢測慢病毒感染效率

慢病毒感染細胞4 d后，將各組細胞分別消化，用PBS洗滌2遍，流式細胞儀檢測細胞GFP的表達，GFP陽性細胞即為成功感染病毒的細胞。

1.4RT-PCR檢測sdha基因的表達

細胞感染慢病毒7 d后，吸出培養(yǎng)基，并用生理鹽水洗一遍，三組細胞，每孔1 mL Trizol收集細胞，提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測A260 nm/A280 nm，計算RNA的濃度和純度。取總RNA 1 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄操作說明書逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取2 μL cDNA加入到20 μL擴增體系中，用PCR儀進行擴增，條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，55℃退火15 s，共40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_用2- Ct法計算，以gapdh作為內(nèi)參基因。

1.5Western蛋白印跡法檢測SDHA的表達

細胞感染慢病毒7 d后，將細胞培養(yǎng)板置于冰上，吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷的生理鹽水洗1遍，3組細胞每孔各加80 μL RIPA細胞裂解液，迅速用細胞刮刮下，轉(zhuǎn)移到EP管內(nèi)，冰上裂解15 min后，16 000×g，4℃離心15 min，棄沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到另一EP管中。用紫外分光光度計測量樣品吸光度值，確定蛋白濃度，進行蛋白質(zhì)定量，上樣進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，膜與抗SDHA抗體或抗β肌動蛋白抗體于4℃孵育過夜（一抗以1∶1000比例稀釋），次日與二抗（二抗以1∶2500比例稀釋）室溫孵育1 h，最后暗室顯影后掃描。掃描條帶用Gelpro計算條帶積分吸光度值（integrated absorbance，IA），SDHA蛋白水平以IASDHA/IAβ肌動蛋表示。

1.6細胞計數(shù)，繪制生長曲線

細胞感染慢病毒后第4天，將各組細胞分別消化，用DMEM培養(yǎng)基重懸，于24孔板內(nèi)每孔接種6×104細胞，24 h后細胞計數(shù)，連續(xù)計數(shù)3 d，繪制細胞生長曲線，對計數(shù)均值進行方差分析。

1.7流式細胞儀檢測BNL CL.2細胞周期和凋亡

細胞感染慢病毒后第7天，胰酶消化，收集1× 106細胞，PBS洗滌2次，加入75%乙醇1 mL，4℃固定過夜。第2天，離心收集細胞后，棄乙醇，并用PBS洗滌1遍。用PBS將RNA酶稀釋至1 g·L-1，每個樣品中加100 μL，輕輕混勻，37℃消化1 h。用PBS將PI稀釋至40 mg·L-1，每個樣品中加100 μL，輕輕混勻，4℃避光染色1 h，流式細胞儀測定G0/G1，S和G2/M期細胞百分率。

感染慢病毒7 d后，收集1×106細胞，用PBS洗滌2次，每個樣品用200 μL結(jié)合緩沖液重懸，各加入1 μL AnnexinⅤ-PE和2 μL 7AAD，輕輕混勻，4℃避光染色30 min，再用流式細胞儀進行磷酯酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡。AnnexinⅤ陽性、7-AAD陰性細胞為早期凋亡細胞；AnnexinⅤ和7-AAD雙陽性細胞為晚期凋亡細胞；細胞凋亡率為二者之和。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1慢病毒感染效率

流式細胞儀檢測結(jié)果（圖1）顯示，sh-control，sh-sdha1或sh-sdha2各5 μL（1×1011TU·L-1）感染BNL CL.2細胞4 d后，細胞表達GFP陽性率均＞80%，表明＞80%的細胞成功感染了慢病毒。

2.2Sdha shRNA慢病毒對sdha基因表達水平的影響

感染7 d后，sh-sdha1或sh-sdha2組細胞sdha基因表達水平比sh-control組低20倍左右（P＜0.01）（圖2），表明該shRNA慢病毒有效降低了sdha基因的表達。靶向sdha的2種不同shRNA均可有效降低sdha基因的表達（圖2）。

Fig.1 Infection efficiency of BNL CL.2 cells infected with lentiviral vectors.BNL CL.2 cells were infected with 5 μL sh-control lentivirus（sh-control），sh-sdha1 or sh-sdha2 lentivirus for 4 d，the viral titer was 1×1011TU·L-1.The GFP positive cells were detected by flow cytometry.

Fig.2　Relative expression level of sdha mRNA in BNL CL.2 cells transfected with lentiviral vectors by RT-PCR.BNL CL.2 cells were infected with sh-control lentivirus，sh-sdha1 or sh-sdha2 for 7 d.Total RNAs were detected by RTPCR analysis.Relative RNA expression of sdha was normalized by gapdh.，n=3.**P＜0.01，compared with sh-control group.

2.3Sdha shRNA慢病毒對SDHA蛋白表達的影響

圖3結(jié)果表明，sdha shRNA慢病毒感染BNL CL.2細胞7 d后，細胞內(nèi)SDHA蛋白表達水平降低。sh-Sdha1或sh-sdha2組細胞SDHA蛋白水平比sh-control組低10倍左右（P＜0.01）。

2.4Sdha shRNA慢病毒對BNL CL.2細胞增殖的影響

細胞計數(shù)及生長曲線結(jié)果（圖4）表明，慢病毒感染后第5天和第6天（即細胞計數(shù)第1天和第2天），sh-sdha1或sh-sdha2組與sh-control組細胞數(shù)目相比并無明顯差異，慢病毒感染后第7天（細胞計數(shù)第3天），sh-sdha1或sh-sdha2組細胞數(shù)目比對照組減少（P＜0.05），表明敲低sdha基因的表達，BNL CL.2細胞系的增殖受到抑制。

Fig.4 Effect of shRNA lentiviral vector of sdha gene on growth curve of BNL CL.2 cell.See Fig.1 for the cell treatment.The cell number of each group was determined under microscope by manual counting.，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with sh-control group.

2.5Sdha shRNA慢病毒對BNL CL.2細胞周期的影響

感染7 d后，流式細胞儀進行細胞周期分析。由圖5可看出，與sh-control組相比，sh-sdha1或sh-sdha2組細胞G0/GI期細胞比例分別下降（7.05± 0.27）%（P＜0.01）和（7.67±0.14）%（P＜0.01），G2/M期細胞比例分別下降（4.80±0.23）%（P＜0.01）和（7.14±0.73）%（P＜0.05），S期細胞比例分別增加（12.17±0.67）%（P＜0.01）和（14.82±0.97）%（P＜0.01），表明敲低sdha基因能誘導(dǎo)細胞S期阻滯，從而抑制細胞增殖。

Fig.5 Effect of shRNA lentiviral vector of sdha gene on BNL CL.2 cell cycle distribution detected by flow cytometry.See Fig.2 for the cell treatment.Cells of each group were stained with propidium iodide and followed by flow cytometry analysis.

2.6Sdha shRNA慢病毒對BNL CL.2細胞凋亡的影響

由圖6可看出，sh-sdha1或sh-sdha2組細胞與sh-control組相比，細胞凋亡率并無明顯差異，shcontrol組細胞凋亡率為（2.66±1.06）%，sh-sdha1 或sh-sdha2組細胞凋亡率分別為（2.52±0.99）%和（2.49±0.17）%，表明敲低sdha基因并不誘導(dǎo)細胞凋亡。

Fig.6 Effect of shRNA lentiviral vector of sdha gene on apoptosis of BNL CL.2 cells detected by flow cytometry.See Fig.2 for the cell treatment.Cells of each group were stained with AnnexinⅤ-PE and 7-AAD，and followed by flow cytometry analysis.

3　討論

本研究在BNL CL.2中，使用慢病毒介導(dǎo)的方法敲低sdha基因表達7 d后，敲低組的細胞數(shù)量與無關(guān)shRNA對照組相比明顯減少。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，sdha基因敲低導(dǎo)致細胞發(fā)生S期阻滯進而延緩細胞增殖，而對細胞凋亡無影響。同時發(fā)現(xiàn)，sdha敲低對細胞的凋亡并無影響。本研究結(jié)果提示，sdha基因敲低后導(dǎo)致BNL CL.2細胞周期阻滯，增殖減緩，使細胞更容易適應(yīng)低能量代謝而避免凋亡，可能是細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的機制之一。在本研究中，由于腫瘤細胞異質(zhì)性的原因，并沒有比較BNL CL.2細胞與小鼠來源的肝細胞癌細胞系之間sdha mRNA和蛋白水平的差異。在后續(xù)的研究中，將會用DEN誘導(dǎo)的小鼠原發(fā)性肝細胞癌模型，對小鼠癌組織、癌旁組織以及正常肝組織SDHA的表達水平進行檢測。另外，篩選sdha基因穩(wěn)定敲低的BNL CL.2細胞克隆，對肝細胞代謝以及細胞惡性轉(zhuǎn)化等指標(biāo)進行檢測，也會為揭示相關(guān)機制及肝細胞癌的預(yù)防和治療提供新的理論基礎(chǔ)。

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Effect of succinate dehydrogenase complex subunit A gene
knockdown on cell proliferation，cell cycle and apoptosis of mouse hepatic cell line BNL CL.2 cells

LI Xin1，CAO Huan-ling2，ZHAO Ya-wei2，GUO Yin-han1，WANG Qing-yang2
（1.Chinese Medicine College，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；
2.Department of Molecular Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVETo investigate the effect of succinate dehydrogenase complex subunit A （sdha）gene on cell proliferation，cell cycle and apoptosis of mouse hepatic cell line BNL CL.2 cells. METHODS The BNL CL.2 cells were transfected by two kinds of sdha-shRNA lentivirus to knockdown sdha gene.The infection efficiency of BNL CL.2 cells infected with lentiviral vectors was analyzed by flow cytometry.The expression of sdha gene and SDHA protein was detected by real-time PCR and Western blotting，respectively.The effect of sdha gene on cell proliferation of BNL CL.2 cells was examined by growth curve，while cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.RESULTS The infection efficiency of BNL CL.2 cells in sh-control group and in sdha-shRNA group was above 80%.Compared with sh-control group，the expression of sdha gene in BNL CL.2 cells infected with sdha-shRNA lentivirus was decreased by about 20 times（P＜0.01），the expression of SDHA protein was decreased by about 10 times（P＜0.01），and the growth rate was about 70%that of sh-control group（P＜0.05）.The cells were arrested in S phase，and the percentage of cells in S phase was 0.74 times that of sh-control group（P＜0.01）.The percentage of cells in G0/GIphase was 1.17 times that of sh-control group（P＜0.01）.The percentage of cells in G2/M was 1.37 times that of sh-control group（P＜0.01）.But there was no obvious difference in the apoptosis rate.CONCLUSION The reduced expression of SDHA protein can inhibit the proliferation of mouse hepatic cells，and the inhibitory mechanism may be cell cycle arrest.There is possibly no relationship between inhibition and cell apoptosis.

succinate dehydrogenase complex subunit A；BNL CL.2 cells；cell proliferation；cell cycle；apoptosis

The project supported by National Science and Technology Major Project of Original New drug Research of China（2013ZX09103003）

GUO Yin-han，E-mail：guoyinhan@163.com；WANG Qing-yang，E-mail：tansun0532@163.com

R363

A

1000-3002（2016）02-0107-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.004

2015-08-11接受日期：2016-01-20）

（本文編輯：賀云霞）

國家科技重大專項（2013ZX09103003）

李 欣，女，碩士研究生，主要從事免疫學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。

郭銀漢，E-mail：guoyinhan@163.com，Tel：（010）52165901；王慶陽，E-mail：tansun0532@163.com，Tel：（010）66930383