孟 濤，苗盼盼，紀(jì)玉青，牛 勇，賓 萍，戴宇飛，鄭玉新（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，化學(xué)污染與健康安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050）

利用原代肝細(xì)胞模型檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化組蛋白H2AX表達(dá)篩選遺傳毒物的方法驗(yàn)證

孟 濤，苗盼盼，紀(jì)玉青，牛 勇，賓 萍，戴宇飛，鄭玉新
（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，化學(xué)污染與健康安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050）

目的 驗(yàn)證以原代小鼠肝細(xì)胞為受試細(xì)胞，以細(xì)胞內(nèi)磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）表達(dá)改變?yōu)闄z測(cè)指標(biāo)的體外檢測(cè)化學(xué)物遺傳毒性的實(shí)驗(yàn)方法。方法 采用改良的兩步膠原酶灌注法分離獲取小鼠肝細(xì)胞，并運(yùn)用三明治法體外培養(yǎng)肝細(xì)胞。選擇4種已知的遺傳毒物平陽(yáng)霉素、苯并芘、苯乙烯和氧化苯乙烯及2種非遺傳毒物硫唑嘌呤和環(huán)孢素A作為受試物，用受試物0～40 μmol·L-1處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞0～24 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γH2AX的表達(dá)水平。結(jié)果 利用所建立的方法篩選上述4種遺傳毒物均獲得陽(yáng)性結(jié)果，2種非遺傳毒物均呈陰性反應(yīng)。直接遺傳毒物平陽(yáng)霉素和氧化苯乙烯作用3 h，間接遺傳毒物苯并芘和苯乙烯作用6 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量最高（P＜0.01）。4種遺傳毒物處理組在最適時(shí)間點(diǎn)（直接遺傳毒物：3 h；間接遺傳毒物：6 h）及最適作用濃度（10 μmol·L-1）誘發(fā)細(xì)胞γH2AX的表達(dá)水平依次為25.7，18.4，12.4和14.2（平均熒光強(qiáng)度），分別為DMSO溶劑對(duì)照組的18，12，8和10倍（P＜0.01），且γH2AX的表達(dá)水平與遺傳毒物濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。非遺傳毒物硫唑嘌呤和環(huán)孢素A處理組與DMSO溶劑和空白對(duì)照組相比，γH2AX的水平均無(wú)明顯變化。結(jié)論 利用原代肝細(xì)胞模型檢測(cè)γH2AX表達(dá)水平可在無(wú)S9的情況下有效區(qū)分遺傳毒物與非遺傳毒物和直接遺傳毒性與間接遺傳毒性。γH2AX表達(dá)水平可作為鑒別遺傳毒物與非遺傳毒物的有效參考指標(biāo)。

遺傳毒物；肝細(xì)胞；原代培養(yǎng)；組蛋白類；流式細(xì)胞術(shù)

近年來(lái)，與環(huán)境致癌物相關(guān)的腫瘤發(fā)生率呈上升趨勢(shì)?；瘜W(xué)致癌物根據(jù)其作用機(jī)制可分為遺傳毒性和非遺傳毒性兩大類，且大多數(shù)致癌物都是遺傳毒物。隨著環(huán)境中新化學(xué)物質(zhì)數(shù)量的激增，人們將會(huì)接觸到更多具有潛在遺傳毒性的化學(xué)物，以動(dòng)物為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，加之動(dòng)物3R原則的推行，建立相對(duì)快速、簡(jiǎn)單、可靠的體外評(píng)價(jià)化學(xué)物潛在遺傳毒性的方法成為當(dāng)前毒理學(xué)發(fā)展的重要方向。由于多數(shù)遺傳毒物均以前致突變劑或前致癌劑的形式存在，需要經(jīng)細(xì)胞色素P450酶代謝活化后才能造成DNA損傷，最后呈現(xiàn)致突變或致癌作用。研究表明，在靶細(xì)胞中加入S9組分最常用于檢測(cè)化學(xué)物的潛在遺傳毒性［1-2］，但該體系靈敏性和特異性較低，存在假陰性和假陽(yáng)性的結(jié)果。隨著肝細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，研究者已成功將原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞模型用于體外化學(xué)物遺傳毒性的篩選［3-4］。肝細(xì)胞內(nèi)含有豐富的代謝酶，且大部分外源化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)可被代謝酶活化，并在不需添加S9組分的情況下，結(jié)合遺傳毒性檢測(cè)方法可直接檢出化學(xué)物的遺傳毒性。目前，已建立了200多種檢測(cè)遺傳毒性的實(shí)驗(yàn)方法，且還在不斷發(fā)展中，其中DNA是遺傳學(xué)檢測(cè)的有效終點(diǎn)之一。遺傳毒物能直接或間接導(dǎo)致各種形式的DNA損傷，包括DNA單鏈斷裂（DNA single-stranded breaks，SSB）、DNA雙鏈斷裂（DNA doublestranded breaks，DSB）、DNA加合物形成、鏈內(nèi)/鏈間交聯(lián)和堿基置換等。其中DNA鏈的斷裂尤其是DSB被認(rèn)為是最嚴(yán)重的DNA損傷方式之一。目前，磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）與DSB之間的關(guān)系逐漸引起研究者的重視。當(dāng)細(xì)胞中發(fā)生DSB時(shí)，H2AX會(huì)被迅速磷酸化，隨后γH2AX在DSB損傷的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可募集其他DNA損傷修復(fù)蛋白到達(dá)損傷位點(diǎn)，對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)［5-6］。進(jìn)一步研究證實(shí)，γH2AX的形成和消失與DSB形成和修復(fù)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系［7-8］。因此，γH2AX可作為一種靈敏檢測(cè)DSB的有效指標(biāo)。目前，各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)γH2AX的方法并非一致，而流式細(xì)胞術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，已被用于γH2AX的檢測(cè)［9-10］。

本研究在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，首先采用改良的兩步膠原酶灌流法分離獲取小鼠肝細(xì)胞，并進(jìn)行三明治法體外培養(yǎng)肝細(xì)胞，建立穩(wěn)定的原代肝細(xì)胞模型。運(yùn)用此模型，結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，建立多聚甲醛固定FITC標(biāo)記γH2AX的流式檢測(cè)法，并用4種已知遺傳毒物平陽(yáng)霉素（bleomycin，BLM）、苯并芘〔benzo （a）pyrene，B（a）p〕、苯乙烯（styrene）和氧化苯乙烯（styrene-7，8-oxide，SO）及2種非遺傳毒物硫唑嘌呤（azathioprine，Aza）和環(huán)孢素A（ciclosporin A，CsA）作為受試物，對(duì)所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，為遺傳毒性體外篩選方法的建立及其科學(xué)性和有效性驗(yàn)證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15只SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量為18～30 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001〕。

1.2主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、WEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰酶、Ⅳ型膠原和谷氨酰胺（美國(guó)Gibco公司）；Ⅰ型鼠尾膠原、Matrigel膠和ITS預(yù)混液（美國(guó)BD公司）；胰島素、地塞米松、Percoll分離液、維生素C、BLM、B（a）p、苯乙烯、SO、Aza、CsA、二甲亞砜（DMSO）、依地酸二鈉（Na2EDTA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、HEPES、MCDI和Triton X-100（美國(guó)Sigma公司）；FITC標(biāo)記的兔抗鼠γH2AX抗體和同型抗體（美國(guó)CST公司）；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；其余均為國(guó)產(chǎn)生化試劑。20 G靜脈留置針和細(xì)胞篩（美國(guó)BD公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BT01-100蠕動(dòng)泵（保定格蘭蠕動(dòng)泵有限公司）；智能恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）。

1.3肝細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

采用改良的兩步膠原酶消化法分離獲取小鼠肝細(xì)胞［11］。①行下腔靜脈插管，以10 mL·min-1輸注預(yù)溫（40°C）灌注液I（mmol·L-1：NaCl 142，KCl 6.7，Na2HPO4·12H2O 0.7，EDTA·Na20.5，HEPES 10，pH為7.4）5 min；②接著以10 mL·min-1輸注預(yù)溫（40°C）含0.04%膠原酶Ⅳ的灌注液Ⅱ（mmol·L-1：NaCl 66.7，KCl 6.7，CaCl24.76，Na2HPO4·12H2O 0.7，HEPES 10，pH值為7.6），待肝表面出現(xiàn)龜狀裂紋后停止灌注，摘取肝并立即轉(zhuǎn)至裝有冷DMEM/10%FBS培養(yǎng)皿內(nèi)，后續(xù)步驟均在冰上進(jìn)行；③輕劃肝包膜，夾住肝蒂輕晃，肝細(xì)胞像泥沙一樣散落下來(lái)，行篩網(wǎng)過(guò)濾后得到細(xì)胞懸液；④將此懸液于4°C，50×g離心5 min后收集細(xì)胞，加入30%Percoll液，同樣條件離心10 min，棄上層液體，加入DMEM/5%FBS接種液，輕輕混勻即可。將肝細(xì)胞懸液（5×108L-1）接種于包被Ⅰ型膠原的培養(yǎng)板內(nèi)，于37°C，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。2 h后棄未貼壁的細(xì)胞，PBS洗滌2次，更換WEM無(wú)血清培養(yǎng)液（終濃度含1×ITS預(yù)混液，1×青鏈霉素混合液，1×谷氨酰胺，地塞米松10 nmol·L-1）。24 h后將更換預(yù)冷、含Matrigel基質(zhì)0.25 g·L-1的無(wú)血清培養(yǎng)液，形成三明治法培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h即可用于后續(xù)染毒。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將肝細(xì)胞按每孔5×104細(xì)胞接種于96孔板并進(jìn)行三明治法培養(yǎng)，于夾層培養(yǎng)第2天開(kāi)始進(jìn)行染毒。6種受試物設(shè)置6個(gè)濃度（0.2，1，5，10，20和40 μmol·L-1）對(duì)細(xì)胞染毒處理，同時(shí)設(shè)置空白及DMSO溶劑對(duì)照組。置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 h后，每孔內(nèi)加入CCK-8染液10 μL，混勻繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，在450 nm處測(cè)定每孔的吸光度值（absorbance，A），計(jì)算肝細(xì)胞與不同濃度受試物共培養(yǎng)后的相對(duì)細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組A－空白組A）/（溶劑對(duì)照組A－空白組A）× 100%。每個(gè)毒物設(shè)3個(gè)平行孔，且該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立實(shí)施5次。選擇細(xì)胞存活率＞80%的毒物劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)受試物作用不同時(shí)間對(duì)H2AX表達(dá)的影響

將肝細(xì)胞按每孔1×106細(xì)胞接種于6孔板，三明治法體外培養(yǎng)24 h后，分別加入BLM、B（a）p、苯乙烯、SO、Aza和CsA 10 μmol·L-1培養(yǎng)0.5，1，3，6，12和24 h染毒。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照和DMSO溶劑對(duì)照組。染毒結(jié)束后，胰酶消化，600×g離心5min收集細(xì)胞，PBS洗滌，緩慢加入預(yù)冷2%多聚甲醛1 mL，4°C靜置30 min；離心棄上清，PBS洗滌，加入10%FBS（以含0.2%TritonX-100的PBS稀釋）200 μL室溫封閉30 min；離心收集細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的兔抗小鼠γH2AX抗體及同型抗體（1∶100）50 μL（以含0.1%BSA和0.2%TritonX-100的PBS稀釋），室溫孵育60 min，PBS洗滌，制成350 μL PBS細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX熒光強(qiáng)度值，該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)5次，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度值并直接進(jìn)行比較。選擇每種受試物γH2AX表達(dá)最高的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)濃度-效應(yīng)的研究。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)受試物不同濃度對(duì) H2AX表達(dá)的影響

將肝細(xì)胞按每孔1×106細(xì)胞接種于6孔板，夾層體外培養(yǎng)24 h后，用受試物BLM和SO處理3 h，B（a）p、苯乙烯、Aza和CsA處理6 h，且各受試物處理濃度設(shè)為0.05，0.1，0.2，1，5和10 μmol·L-1。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和DMSO溶劑對(duì)照組。染毒結(jié)束，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、多聚甲醛固定、FBS封閉及FITC標(biāo)記的兔抗小鼠γH2AX抗體孵育后，制成PBS細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX熒光強(qiáng)度值，該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)5次，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度值并直接進(jìn)行比較。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)胞存活率和γH2AX含量（平均熒光強(qiáng)度值）均屬于正態(tài)分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并用Pearson相關(guān)分析探討毒物濃度與γH2AX表達(dá)的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1受試物不同濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響

由表1可見(jiàn)，在6種受試物處理組中，隨著染毒濃度的增加，受試物的細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)，而細(xì)胞相對(duì)存活率逐漸降低。不同受試物在10 μmol·L-1染毒濃度下對(duì)肝細(xì)胞均顯示了相對(duì)較低的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致15%～20%細(xì)胞死亡，細(xì)胞存活率均＞80%；當(dāng)各受試物濃度增加到20 μmol·L-1時(shí)，會(huì)導(dǎo)致約＞30%的細(xì)胞死亡；而空白對(duì)照和DMSO對(duì)照組無(wú)明顯改變。選擇染毒24 h細(xì)胞相對(duì)存活率＞80%的作用濃度進(jìn)行后續(xù)化學(xué)物遺傳毒性的檢測(cè)。

Tab.1 Effect of chemicals on cell viability by CCK-8 assays

2.2受試物作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi) H2AX表達(dá)水平的影響

由表2可見(jiàn)，4種遺傳毒物均能引起γH2AX的表達(dá)升高，不同的遺傳毒物誘導(dǎo)肝細(xì)胞γH2AX表達(dá)的時(shí)間規(guī)律并不相同，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)其γH2AX水平呈先升后降的趨勢(shì)。BLM和SO處理組作用0.5 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量明顯高于DMSO對(duì)照組，其值分別約為DMSO對(duì)照組的4和3倍（P＜0.05）；作用3 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量最高，分別約為DMSO對(duì)照組的18和10倍（P＜0.01）；作用6 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量開(kāi)始降低，分別約為DMSO對(duì)照組的7和4倍（P＜0.01）；作用24 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量逐漸接近或回復(fù)到DMSO對(duì)照組水平，分別約為DMSO對(duì)照組的2和1倍。B（a）p和苯乙烯處理組作用1 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量明顯高于DMSO對(duì)照組，其值約為DMSO對(duì)照組的2倍（P＜0.05）；作用6 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量最高，分別約為DMSO對(duì)照組的12和8倍（P＜0.01）；作用12 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量開(kāi)始降低，分別約為DMSO對(duì)照組的5和2倍（P＜0.05）；作用24 h時(shí)，γH2AX表達(dá)量逐漸接近或回復(fù)到DMSO對(duì)照組水平，分別約為DMSO對(duì)照組的2和1倍。2種非遺傳毒物Aza和CsA處理組與DMSO對(duì)照組相比，γH2AX表達(dá)量在24 h內(nèi)無(wú)明顯改變。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇BLM和SO作用3 h，B（a）p、苯乙烯、Aza和CsA作用6 h。

Tab.2 Effect of exposure time of chemicals on H2AX level

2.3受試物不同濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi) H2AX表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照和DMSO溶劑對(duì)照組相比，4種遺傳毒物BLM、B（a）p、苯乙烯和SO組均呈陽(yáng)性反應(yīng)；肝細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)量均增加并呈濃度效應(yīng)關(guān)系，確定產(chǎn)生遺傳毒性的最低有效濃度分別為0.1，0.2，0.2和0.2 μmol·L-1；當(dāng)作用濃度達(dá)到10 μmol·L-1時(shí)，γH2AX表達(dá)量分別約為DMSO溶劑對(duì)照組的18，12，8和10倍（P＜0.01）。2種非遺傳毒物Aza和CsA組隨著染毒劑量的增加細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化。因此，γH2AX表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)化學(xué)物遺傳毒性的有效標(biāo)記（表3）。

Tab.3 Effect of different concentrations of chemicals on H2AX level

經(jīng)Pearson相關(guān)分析進(jìn)一步探討了受試化學(xué)物染毒濃度與γH2AX表達(dá)之間的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種遺傳毒物BLM在0.1～10 μmol·L-1，B（a）p、苯乙烯和SO在0.2～10 μmol·L-1范圍內(nèi)染毒濃度與γH2AX水平均呈顯著的正相關(guān)（P＜0.01），且它們之間的擬合關(guān)系均符合直線方程，方程式分別為Y=1.9875X+6.7928，Y=1.362X+4.5895，Y= 0.9483X+3.0294和Y=1.024X+4.2118，各組對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.906，0.916，0.913和0.894。

3　討論

為了更好地控制環(huán)境中化學(xué)致癌物，尤其是防止接觸遺傳毒物，預(yù)防腫瘤的發(fā)生，快速且準(zhǔn)確地體外檢測(cè)環(huán)境中的致癌物成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。體外研究模型的科學(xué)性和合理性直接影響研究結(jié)果的可靠性，建立理想的研究模型有助于更好地研究化學(xué)致癌物的毒性效應(yīng)及其機(jī)制。因此，選擇合適的靶細(xì)胞模型對(duì)于化學(xué)物潛在遺傳毒性的篩選至關(guān)重要，尤其是對(duì)需要經(jīng)過(guò)代謝后產(chǎn)生遺傳毒性的化學(xué)物。本課題組前期通過(guò)改良的兩步膠原酶灌流法，建立了有效和穩(wěn)定的原代肝細(xì)胞模型，從而為后續(xù)化學(xué)物遺傳毒性的體外篩選提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。該模型與以往文獻(xiàn)報(bào)道的原代細(xì)胞檢測(cè)模型相比，共同之處為代謝酶種類豐富，酶活力高及活性下降慢，與體內(nèi)代謝情況的一致性較好，靈敏度高，不易導(dǎo)致化合物漏檢；不同之處為該模型可在相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間（7 d）維持高水平的代謝酶活性，從而可延長(zhǎng)化學(xué)物的處理時(shí)間［3-4］。本研究通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)γH2AX水平變化，間接反映化學(xué)物對(duì)細(xì)胞遺傳物質(zhì)DSB及修復(fù)，且首次利用原代肝細(xì)胞模型結(jié)合γH2AX指標(biāo)進(jìn)行遺傳毒物的篩選，并用4種陽(yáng)性受試物和2種陰性受試物初步驗(yàn)證該篩選法具有較好的靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性。與公認(rèn)的檢測(cè)遺傳毒性的方法（彗星實(shí)驗(yàn)）相比，該篩選法可較早地并在低濃度下檢出陽(yáng)性受試物的遺傳毒性，即該篩選法具有較好的靈敏性，且與彗星實(shí)驗(yàn)具有較好的一致性。

研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射、遺傳毒物如順鉑和喜樹(shù)堿可誘導(dǎo)γH2AX的表達(dá)，且γH2AX的形成與消失與DSB的形成與修復(fù)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系［7-8，12-13］。因此，γH2AX已被認(rèn)為是一種靈敏檢測(cè)DSB的準(zhǔn)確、特異性的指標(biāo)，已被用于電離輻射、多種化合物誘導(dǎo)的DSB形成和修復(fù)的研究中。目前，檢測(cè)γH2AX的方法主要包括免疫熒光、免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)，這3種方法在檢測(cè)范圍、檢測(cè)指標(biāo)、檢測(cè)便捷程度及樣品用量等方面均有差異。由于流式細(xì)胞儀目前已廣泛應(yīng)用于科研和臨床中，其操作簡(jiǎn)單快速。因此，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γH2AX具有較好的應(yīng)用前景。然而，不同實(shí)驗(yàn)室γH2AX的流式檢測(cè)方法并不完全一致，不同的固定液和熒光標(biāo)記均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果［9-10，14］，且不利于不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比較。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在使用FITC單標(biāo)法時(shí)固定劑多聚甲醛的劑量反應(yīng)優(yōu)于乙醇［14］，在實(shí)驗(yàn)中選擇2%多聚甲醛的固定方式進(jìn)行流式檢測(cè)，并對(duì)濃度反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行直線擬合，相關(guān)系數(shù)約0.9，提示多聚甲醛固定方式獲得的γH2AX濃度效應(yīng)的直線趨勢(shì)較好。因此，應(yīng)用多聚甲醛固定的單標(biāo)法進(jìn)行流式檢測(cè)是適用于γH2AX表達(dá)與化學(xué)物暴露相關(guān)性研究的測(cè)定方法。

本研究觀察了不同遺傳毒物BLM、B（a）p、苯乙烯和SO在24 h時(shí)間段內(nèi)的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0.5，1，3，6，12和24 h）γH2AX的表達(dá)情況，其含量均呈先升后降趨勢(shì)，但同時(shí)顯示不同類型的遺傳毒物誘導(dǎo)γH2AX表達(dá)的時(shí)間并不相同，BLM和SO作用3 h 時(shí)γH2AX含量最高，而B（a）p和苯乙烯作用6 h時(shí)γH2AX含量最高。因此，本研究可根據(jù)γH2AX的峰值時(shí)間有效區(qū)別化學(xué)物具有直接遺傳毒性還是需代謝活化后具有間接遺傳毒性。另外，結(jié)果顯示，該法可較早（染毒0.5 h）檢出直接遺傳毒物的γH2AX含量變化，而相對(duì)較晚（染毒1 h）檢出代謝后具有遺傳毒性化學(xué)物的γH2AX含量變化，這些均可能是由于遺傳毒物本身的特性引起，BLM和SO具有直接遺傳毒性，其中BLM屬于擬X射線的致突變劑，可直接導(dǎo)致DNA鏈斷裂，而SO為苯乙烯的活性中間代謝產(chǎn)物，具有親核性，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA共價(jià)結(jié)合，可直接導(dǎo)致DNA損傷，通過(guò)本研究進(jìn)一步驗(yàn)證SO為苯乙烯的關(guān)鍵遺傳毒性代謝產(chǎn)物。而B（a）p和苯乙烯具有間接遺傳毒性，需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450酶家族成員的代謝活化后才具有損傷DNA的能力，這與BLM和SO不同。各遺傳毒物誘導(dǎo)的γH2AX水平達(dá)到峰值后，隨后逐漸下降，原因可能是：①化學(xué)物或活性代謝產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)水解而失去活性，不會(huì)繼續(xù)導(dǎo)致DNA損傷；②隨著遺傳毒物所致DSB的重新連接修復(fù)，γH2AX在磷酸酶2A的作用下發(fā)生去磷酸化［15］，即γH2AX水平開(kāi)始衰減，處理組γH2AX水平在短時(shí)間內(nèi)快速增加，達(dá)到峰值后進(jìn)入快速衰減然后轉(zhuǎn)變?yōu)榫徛p。這一結(jié)果與DNA損傷及修復(fù)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)的基本知識(shí)一致［16］，即DNA損傷早期為快速修復(fù)，晚期為緩慢修復(fù)。在24 h內(nèi)苯乙烯和SO γH2AX水平回復(fù)到對(duì)照組水平，而BLM和B（a）p接近DMSO溶劑對(duì)照組水平，由于觀察時(shí)間有限，未得到BLM和B（a）p的γH2AX水平衰減的完整曲線。另有研究發(fā)現(xiàn)，B（a）p處理FL細(xì)胞和HeLa細(xì)胞均可誘導(dǎo)γH2AX的表達(dá)，且具有較好的濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，即隨著濃度的增加或時(shí)間的延長(zhǎng)，γH2AX水平呈上升趨勢(shì)［17］，這與本研究結(jié)果不同，提示在檢測(cè)遺傳毒性時(shí)還需要考慮靶細(xì)胞的代謝能力。由于不同的遺傳毒物誘導(dǎo)γH2AX的形成及變化過(guò)程不同，尤其是需要經(jīng)過(guò)代謝的遺傳毒物，因此需要選擇合適的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)γH2AX表達(dá)。此外，與DMSO溶劑對(duì)照組相比，4種遺傳毒物在24 h內(nèi)可見(jiàn)明顯的先升后降的變化，而2種非遺傳毒物未見(jiàn)明顯的變化，初步提示該法具有較高的靈敏性和特異性。由于化合物種類繁多，還需選擇其他化合物做進(jìn)一步的方法驗(yàn)證。

根據(jù)γH2AX形成的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，確定4種遺傳毒物γH2AX的最佳的作用時(shí)間，然后觀察各毒物不同濃度在對(duì)應(yīng)時(shí)間內(nèi)γH2AX的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BLM 0.1 μmol·L-1與Bap、苯乙烯及SO 0.2 μmol·L-1處理組γH2AX水平較DMSO對(duì)照組顯著增加，提示該法具有較好的靈敏性，在較低濃度即可檢出受試物的遺傳毒性；4種遺傳毒物均可顯著誘導(dǎo)γH2AX的表達(dá)，且具有明顯的劑量依賴性，最高濃度10 μmol·L-1作用后γH2AX表達(dá)最多（熒光強(qiáng)度最強(qiáng)），且此濃度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率＞80%，細(xì)胞死亡率僅在15%～20%之間。不同濃度2種非遺傳毒物作用6 h，γH2AX的表達(dá)與DMSO對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，提示該法具有較好的特異性。為降低細(xì)胞毒性對(duì)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究將CCK-8法與γH2AX流式法相結(jié)合，在保證較高的細(xì)胞存活率的基礎(chǔ)上檢測(cè)受試物的遺傳毒性，能更真實(shí)反映受試物的毒性特點(diǎn)。此外，Banáth等［18］研究發(fā)現(xiàn)，γH2AX形成的強(qiáng)度與細(xì)胞的死亡率也有一定關(guān)系，即γH2AX焦點(diǎn)形成越強(qiáng)，細(xì)胞的死亡率越高。另外，我們也用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各遺傳毒物20 μmol·L-1誘導(dǎo)γH2AX的表達(dá)水平，此時(shí)細(xì)胞存活率基本＜70%（數(shù)據(jù)略），與Banáth等得出的結(jié)果是一致的，推測(cè)γH2AX表達(dá)既能較好地反映細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度，也能很好地反映細(xì)胞的存活情況。此外，本研究通過(guò)Pearson相關(guān)分析探討了染毒濃度與γH2AX表達(dá)之間的關(guān)系，二者具有較好的線性關(guān)系，且各毒物相關(guān)系數(shù)均約在0.9。

綜上所述，當(dāng)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞暴露于化學(xué)物中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX含量的變化，通過(guò)γH2AX水平能反映出化學(xué)物誘發(fā)的DSB及修復(fù)情況，可在不添加S9情況下來(lái)區(qū)分遺傳毒物與非遺傳毒物，并根據(jù)γH2AX含量峰值出現(xiàn)時(shí)間來(lái)區(qū)分化學(xué)物直接具有遺傳毒性作用還是經(jīng)代謝活化后間接具有遺傳毒性作用。本研究結(jié)果顯示，4種不同的遺傳毒物均能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)升高，而非遺傳毒物未引起γH2AX明顯改變，提示γH2AX指標(biāo)可作為確定化學(xué)物是否具有遺傳毒性的參考指標(biāo)；具有直接遺傳毒性的化學(xué)物γH2AX含量的峰值時(shí)間接近3 h，經(jīng)代謝后才具有遺傳毒性的化學(xué)物其峰值時(shí)間接近6 h，提示γH2AX峰值出現(xiàn)時(shí)間可作為確定遺傳毒物屬于直接的還是間接的。這些數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實(shí)了利用原代肝細(xì)胞模型檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)的改變來(lái)進(jìn)行初步、快速篩選潛在遺傳毒物是可行的。然而，本研究目前無(wú)法根據(jù)γH2AX水平的變化制定出判斷化學(xué)物遺傳毒性強(qiáng)弱的判定標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)研究還有待進(jìn)一步探索。

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Method validation of phosphorylated histone H2AX level detection using primary cultured hepatocytes in genotoxic agent screening

MENG Tao，MIAO Pan-pan，JI Yu-qing，NIU Yong，BIN Ping，DAI Yu-fei，ZHENG Yu-xin
（Key Laboratory of Chemical Safety and Health，National Institute of Occupational Health and Poison
Control，Chinese Center for Disease Prevention and Control，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE To establish an in vitro test method and to evaluate the genotoxicity of chemicals using primary cultured mouse hepatocytes and the changes in phosphorylated histone H2AX（γH2AX）expression levels to provide a more reliable marker of the identification of genotoxicity. METHODS Hepatocytes were isolated from BALB/c mice by an improved two-step collagenase digestion method and then cultured in sandwich configuration.The primary cultured hepatocytes were treated with various concentrations of four known genotoxic agents bleomycin（BLM），benzo（a）pyrene〔B （a）p〕，styrene and styrene-7，8-oxide（SO）within the range of 40 μmol·L-1and two non-genotoxic agents azathioprine（Aza）and ciclosporin A（CsA）at different time points within 24 h.The cytotoxicity induced by these toxicants was assessed by CCK-8 assay.Then，the changes in γH2AX expressionlevels in treated cells were determined by flow cytometry.RESULTS The four genotoxic agents could be detected and two non-genotoxic agents could not be detected by this method.The γH2AX expression level was the highest when hepatocytes were exposed to BLM and SO for 3 h，or B（a）p and styrene for 6 h（P＜0.01）.The production of γH2AX was 25.67，18.36，12.43 and 14.25 for the four types of genotoxic agents，respectively，and was approximately 19，13，9 and 11 times that of the vehicle control group（P＜0.01）at the optimum time point and concentration.There was a significant positive correlation between the indicated concentrations of genotoxic chemicals and γH2AX expression levels（P＜0.01）.In addition，the production of γH2AX indicated no marked increase in two non-genotoxic agents such as Aza and CsA in comparison with the control group.CONCLUSION This test method can effectively distinguish genotoxic agents from non-genotoxic agents，and direct genotoxic agents from indirect genotoxic agents in the absence of S9.γH2AX might be a reliable marker for the identification of the potential genotoxicity of chemicals.

genotoxic agents；hepatocytes；primary culture；histones；flow cytometry

The project supported by National Key Technology Research and Development Program of China （2014BAI12B02）；Youth Science Foundation of National Institute of Occupational Health and Poison Control of China CDC（2014YS02）；and Youth Science Foundation of National Institute of Occupational Health and Poison Control of China CDC（2015YS01）

ZHENG Yu-xin，Tel：（010）83132593，E-mail：zhengyx@chinacdc.cn

R394.6，R965.1

A

1000-3002（2016）02-0135-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.008

2015-08-22接受日期：2015-11-20）（本文編輯：?jiǎn)?虹）

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014-BAI12B02）；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所青年科技基金資助項(xiàng)目（2014YS02）；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所青年科技基金資助項(xiàng)目（2015YS01）

孟 濤，女，博士，助理研究員，主要從事化學(xué)物致病生物標(biāo)志物及其機(jī)制研究，E-mail：taotao198307@163.com

鄭玉新，E-mail：zhengyx@chinacdc.cn，Tel：（010）83132593