馬　玲， 李　麗， 張明媚， 孫家琳， 周　維， 顧永欣， 錢(qián)　一， 易湘龍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊　830011； 2第五附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊　830011；3第一附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊　830054；4中國(guó)人民解放軍474醫(yī)院， 烏魯木齊　830013)

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1,25(OH)2D3對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者單個(gè)核細(xì)胞增殖與分泌細(xì)胞因子的影響

馬玲1， 李麗2， 張明媚3， 孫家琳1， 周維3， 顧永欣4， 錢(qián)一3， 易湘龍3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊830011；2第五附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊830011；3第一附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊830054；4中國(guó)人民解放軍474醫(yī)院， 烏魯木齊830013)

目的探討體外1,25(OH)2D3對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR)單個(gè)核(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的影響。方法選擇維吾爾族增殖期DR患者20例(PDR組)，非增殖期DR患者24例(NPDR組)、正常對(duì)照22例(NC組)，分離受試者外周血PBMCs細(xì)胞，體外1,25(OH)2D3刺激后用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；分離PBMCs后加入抗CD3/CD28抗體活化，加或不加1,25(OH)2D3培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并使用Cytometric Bead Array技術(shù)檢測(cè)上清中細(xì)胞因子的水平。結(jié)果1,25(OH)2D3能顯著抑制DR患者和正常對(duì)照的PBMCs細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且1,25(OH)2D3能抑制DR患者和正常對(duì)照的PBMCs分泌IL-17A、IFN-γ和IL-6因子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論1,25(OH)2D3作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)DR患者免疫細(xì)胞的增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌具有抑制作用。

糖尿病視網(wǎng)膜病變； 1,25(OH)2D3； 單個(gè)核細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞因子

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR)是成年人中失明的常見(jiàn)原因。糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)患者由于長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，導(dǎo)致許多并發(fā)癥的發(fā)生，其中DR是DM最嚴(yán)重和最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥。

1,25(OH)2D3是新被認(rèn)識(shí)的免疫調(diào)節(jié)劑，在許多炎癥性疾病包括糖尿病的發(fā)病中起到重要作用[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)維生素D是通過(guò)其活性形式1,25(OH)2D3與細(xì)胞核維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)結(jié)合而調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[2]。幾乎所有的免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞表面都有VDR的表達(dá)[3]。T淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起到核心作用，1,25(OH)2D3通過(guò)直接和間接的方式調(diào)節(jié)T細(xì)胞，當(dāng)T細(xì)胞被激活后會(huì)引起Th1和Th2信號(hào)活化，抑制Th1和Th17細(xì)胞，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[4]。體外實(shí)驗(yàn)表明, 1,25(OH)2D3可以抑制T細(xì)胞增殖、分化以及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[5]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DR的發(fā)展與細(xì)胞因子的變化有關(guān)，DR患者血清中1,25(OH)2D3含量顯著降低，從而推測(cè)1,25(OH)2D3可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)而影響DR發(fā)展。本研究進(jìn)一步探究1,25(OH)2D3對(duì)DR患者免疫細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的影響。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象選取2015年3-12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、第五附屬醫(yī)院和中國(guó)人民解放軍474醫(yī)院眼科確診的DR患者，正常對(duì)照選取體檢中心健康志愿者。以中國(guó)糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)\斷治療指南(2014版)[6]將研究對(duì)象分為3組：DR增殖期20例(PDR組)，DR非增殖期24 例(NPDR組)，正常對(duì)照22例(NC組)；所有研究對(duì)象進(jìn)入之前均未服用維生素D或鈣補(bǔ)充劑、肝腎功能正常、無(wú)急性或慢性免疫相關(guān)疾病、診斷為2型DM。本研究遵循赫爾辛基宣言并且已通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集抽取研究對(duì)象的外周血5 mL，注入含EDTA-K2的抗凝管中，輕微混勻，所有血樣均在12 h以內(nèi)處理。1.2.2細(xì)胞分離與培養(yǎng)細(xì)胞分離：將EDTA-K2的抗凝管中的靜脈血與PBS以1∶1等體積稀釋?zhuān)×馨图?xì)胞分離液每管3 mL加入已消毒的離心管，用吸管吸取抗凝血在淋巴細(xì)胞分離液上沿試管壁緩慢滴入，稀釋血樣置于分離液上，血與分離液的比例為3∶2，800 g離心20 min，離心后PBMCs懸浮于中間呈白膜狀，用吸管吸取PBMCs后用PBS洗滌。細(xì)胞培養(yǎng)：加入適當(dāng)?shù)?640培養(yǎng)液即成PBMCs懸液，接種于96孔板中，接種濃度為1×106個(gè)/mL。

1.2.3濃度梯度實(shí)驗(yàn)向PBMCs細(xì)胞中加入不同濃度的1,25(OH)2D3作為刺激劑，分別為1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L,不加1,25(OH)2D3作為對(duì)照，培養(yǎng)5 d，用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖，選取最佳1,25(OH)2D3刺激濃度，此1,25(OH)2D3濃度應(yīng)用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.41,25(OH)2D3對(duì)PBMCs細(xì)胞增殖的影響將1×106個(gè)/mL 的DR病人和正常對(duì)照PBMC細(xì)胞懸液接種于96孔圓底培養(yǎng)板，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，加入1,25(OH)2D3作為刺激劑，不加1,25(OH)2D3作為對(duì)照，每個(gè)濃度做3個(gè)副孔；培養(yǎng)72 h測(cè)定細(xì)胞增殖變化。

1.2.51,25(OH)2D3對(duì)PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響向PBMCs細(xì)胞中加入抗CD3和抗CD28抗體共同培養(yǎng)，體外加入1,25(OH)2D3進(jìn)行刺激，培養(yǎng)72 h，采用Cytometric Bead Array(CBA)技術(shù)檢測(cè)上清Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子。

2　結(jié)果

2.1不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)DR患者和NC組的PBMCs細(xì)胞增殖的影響用不同濃度的1,25(OH)2D3對(duì)4例DR患者和5例NC組的PBMCs細(xì)胞刺激培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1，發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3對(duì)DR患者和正常人的PBMCs細(xì)胞增殖有抑制作用，其作用濃度在1×10-10～1×10-6mol/L范圍內(nèi)呈劑量依賴性，在1×10-7mol/L和1×10-6mol/L濃度時(shí)抑制增殖程度達(dá)到最高，結(jié)合參考文獻(xiàn)[2]，最終確定1×10-7mol/L為最佳刺激濃度。

2.2體外不同分期DR患者和正常對(duì)照者的PBMCs細(xì)胞在1,25(OH)2D3刺激下細(xì)胞增殖的變化體外使用1×10-7mol/L的1,25(OH)2D3對(duì)PBMCs細(xì)胞進(jìn)行刺激后發(fā)現(xiàn)，使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間細(xì)胞增殖變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間細(xì)胞增殖變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中PDR組(n=9)的細(xì)胞增殖高于NPDR組(n=9)和NC組(n=7)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1,25(OH)2D3刺激前后每組的細(xì)胞增殖均被顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.31,25(OH)2D3對(duì)PBMCs細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響分離PDR組(n=11)、NPDR組(n=10)和NC組(n=10)的PBMCs，在抗CD3和抗CD28的共同培養(yǎng)條件下，用1×10-7mol/L濃度的1,25(OH)2D3對(duì)PBMCs進(jìn)行刺激。

2.3.1體外1,25(OH)2D3對(duì)PBMCs分泌IL-17A的影響使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間IL-17A分泌差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間IL-17A分泌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中PDR組高于NPDR組和NC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3刺激前后每組的IL-17A分泌均被顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.3.2體外1,25(OH)2D3對(duì)PBMCs分泌IFN-γ的影響使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間IFN-γ分泌差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間IL-17A分泌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中PDR組高于NPDR組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3刺激前后每組的IFN-γ分泌均被顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.3.3體外1,25(OH)2D3對(duì)PBMCs分泌IL-6的影響使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間IL-6分泌差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未使用1,25(OH)2D3刺激的3組之間IL-6分泌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中PDR組高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3刺激前后每組的IL-6分泌均被顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

3　討論

DR的發(fā)病與免疫和低度炎性反應(yīng)有關(guān)，1,25(OH)2D3是一種免疫調(diào)節(jié)劑，在DR發(fā)病中起重要作用。本課題組前期研究表明，DR患者血清中1,25(OH)2D3含量顯著降低，同時(shí)DR患者血清中低水平IFN-γ和高水平IL-6是加劇DR患者視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)因素，本研究進(jìn)一步探討了1,25(OH)2D3對(duì)DR患者免疫細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子的影響。

T淋巴細(xì)胞增殖是免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)中的重要因素之一，PBMCs細(xì)胞是重要的T淋巴細(xì)胞，在II型DM的發(fā)病機(jī)制中，T細(xì)胞的激活會(huì)引起胰島素抵抗增強(qiáng)和降低胰島分泌功能[7]。本研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可以顯著抑制DR患者和正常人的PBMCs細(xì)胞增殖，證明1,25(OH)2D3具有抗炎癥免疫效果。

IL-17A是由Th17細(xì)胞分泌的促炎癥因子，其在一些自身免疫性疾病和DM患者體內(nèi)表達(dá)顯著增高[8-9]，Marwaha等[9]研究表明，如果能阻斷T細(xì)胞分泌IL-17A可以有效緩解I型DM的發(fā)展，因此本研究進(jìn)一步探究了1,25(OH)2D3對(duì)PBMCs分泌IL-17A的影響，結(jié)果表明無(wú)論對(duì)DR患者還是正常人，1,25(OH)2D3均可以顯著抑制IL-17A分泌，IL-17A隨著DR病變的加劇分泌顯著增加，提示1,25(OH)2D3對(duì)不同分期DR患者PBMCs分泌IL-17A因子都有抑制作用。Tang等[10]的研究也得出了類(lèi)似的結(jié)論，1,25(OH)2D3可以預(yù)防或部分緩解自身免疫性葡萄球膜炎的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)發(fā)現(xiàn)患者伴有血清中IL-17A水平顯著下降。

IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的典型因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ隨著DR病變的加劇分泌顯著增加，而1,25(OH)2D3顯著抑制PBMCs分泌IFN-γ。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn) IFN-γ在一些病毒引起的疾病中起到了促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而有效地誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)拮抗病毒損害，起到促炎癥因子的作用[12]。而最近研究發(fā)現(xiàn)其在一些自身免疫性疾病的動(dòng)物模型中發(fā)揮抗炎癥因子的作用，從而有效地緩解免疫反應(yīng)癥狀[11, 13]。本研究提示，DR患者的PBMCs分泌IFN-γ顯著增高，1,25(OH)2D3可能作為抗炎癥因子從而有效抑制PBMCs分泌IFN-γ。這與本課題組在其他自身免疫性疾病中的研究結(jié)果一致[14]。

IL-6是由Th2細(xì)胞分泌的一種促炎癥細(xì)胞因子，IL-6在DR發(fā)展中的重要作用包括調(diào)控免疫反應(yīng)，刺激視網(wǎng)膜血管生成和血管通透性增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn)PDR患者的PBMCs分泌IL-6顯著增高，而1,25(OH)2D3可以顯著抑制PBMCs分泌IL-6。Terao等[16]研究也得出了類(lèi)似結(jié)論，維生素D類(lèi)似物可以通過(guò)抑制Th2細(xì)胞分泌IL-6而有效緩解自身免疫性疾病皮膚多發(fā)性硬化的癥狀。因此，IL-6可能是一種有效的促血管生成因子，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而1,25(OH)2D3可以抑制DR患者PBMCs釋放IL-6。

綜上所述，本研究證實(shí)了1,25(OH)2D3可以抑制PBMCs細(xì)胞的增殖，同時(shí)可以顯著抑制PBMCs合成和分泌相關(guān)細(xì)胞因子，為探究1,25(OH)2D3在DR發(fā)病機(jī)制中的作用提供了體外研究的證據(jù)。

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(本文編輯張巧蓮)

The effect of 1,25-Dihydroxyvitamin D3on the proliferation and cytokines secretion of peripheral blood mononuclear cells come from diabetic retinopathy patients

MA Ling1, LI Li2, ZHANG Mingmei3, SUN Jialin1, ZHOU Wei3, GU Yongxin4, QIAN Yi3, YI Xianglong3

(1SchoolofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；2DepartmentofOphthalmology,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；3DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China；4DepartmentofOphthalmology,Chinapeople'sLiberationArmy474hospital,Urumqi830013,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 1,25(OH)2D3on the proliferation and secretion of cytokines in the Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from diabetic retinopathy(DR). MethodsThe subjects were collected from 20 proliferative DR, 24 non proliferative DR and 22 normal controls in our hospitals. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with or without 1,25(OH)2D3to detect the change of proliferation. The Cell Counting Kit was used to determine the rate of cell proliferation. PBMCs were cultured with or without 1, 125(OH)2D3in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 to detect the change of secretion of cytokines. The Cytometric Bead Array system was used to analyse cytokine levels in the culture supernatant. Results1,25(OH)2D3significantly inhibited the proliferation of PBMCs and the secretion of IL-17A, IFN-γ and IL-6 cytokines (P<0.05). Conclusion1,25(OH)2D3may be play as an immune modulating agent to suppress cell proliferation and related cell cytokines among DR patients． Keywords: diabetic retinopathy; 1,25-dihydroxyvitamin D3; peripheral blood mononuclear cells; cytokines

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260150，81560161)； 國(guó)家教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金新教師類(lèi)(20126517120004)； 中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(2014M562485)； 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年科研基金(2012QN08)； 新疆醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)啟動(dòng)基金(CXCY092)

馬玲(1975-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與慢性病。

易湘龍，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：眼底病近視矯正及角膜移植，E-mail: xly1010@sina.com。

R77; R34

A

1009-5551(2016)09-1091-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.003

2016-03-16]