李　麗， 易湘龍， 錢　一， 周　維， 趙春煥， 梅　波

(新疆醫(yī)科大學1第五附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊　830011; 2第一附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊　830054)

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維生素D受體SNPs基因多態(tài)性與新疆漢族2型糖尿病視網(wǎng)膜病變相關性研究

李麗1， 易湘龍2， 錢一2， 周維2， 趙春煥2， 梅波2

(新疆醫(yī)科大學1第五附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊830011;2第一附屬醫(yī)院眼科， 烏魯木齊830054)

目的探討維生素D受體(VDR)BsmⅠ、 ApaⅠ、 FokⅠ 、TaqⅠ基因多態(tài)性與新疆漢族2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的關系。方法589例新疆漢族T2DM患者入選，其中非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者181例，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者146例，無糖尿病視網(wǎng)膜病變患者262例。抽取血液樣本提取DNA。采用iMLDR技術進行VDR基因BsmⅠ、 ApaⅠ、 FokⅠ 、TaqⅠ位點基因分型，計算等位基因及基因型并進行χ2檢驗 。結果3組rs1544410、rs7975232、rs2228570及rs731236基因型及等位基因分布頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ 4個SNPs的多態(tài)性與新疆漢族2型糖尿病視網(wǎng)膜病變無關。

糖尿病視網(wǎng)膜病變； 維生素D受體； 基因多態(tài)性

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常見的微血管并發(fā)癥和致盲性眼病之一。DR的發(fā)病機制尚未闡明。近年來，有關DR基因多態(tài)性的研究不斷深入，而維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)基因多態(tài)性與DR的相關性逐漸成為研究熱點[1-3]。本研究通過iMLDR技術進行SNP分型，檢測并分析新疆漢族2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者rs1544410、rs7975232、rs2228570及rs731236共4個VDR SNPs位點基因多態(tài)性，探討VDR基因多態(tài)性與DR的相關性。

1　對象和方法

1.1研究對象篩選2014年1月-2015年12月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科及第五附屬醫(yī)院住院患者。納入標準：(1)新疆地區(qū)居住20 a以上的漢族居民；(2)T2DM病程≥3 a者；(3)已接受胰島素或口服降血糖藥物治療者；(4)同意血樣抽取行DNA檢查者。排除標準：(1)T1DM患者；(2)急性或慢性炎癥者；(3)腎功能衰退者；(4)與已入選對象有血緣關系者。589例新疆漢族T2DM患者入選，其中非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者181例(NPDR組)(年齡49～82歲，DM病程4～31 a，糖化血紅蛋白6.5%～8.8%)，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者146例(PDR組)(年齡47～79歲，DM病程4～27 a，糖化血紅蛋白6.6%～9.2%)，無糖尿病視網(wǎng)膜病變患者262例(T2DM組)(年齡44～82歲，DM病程4～28 a，糖化血紅蛋白5.6%～8.9%)。DR分期標準依據(jù)《我國糖尿病視網(wǎng)膜病病變臨床診療指南(2014年)》[4]。本研究遵循Helsinki宣言，經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑引物(上海生工生物工程公司),Taq DNA聚合酶(Qiagen公司，Inc.),dNTP(GENERAY BIOTECH),PCR反應緩沖液(TAKARA),PCR Marker(NEW ENGLAND BIOLABS),瓊脂糖(BIOWEST)等。

1.3方法 1.3.1DNA提取用EDTA試管抽取外周全血5 mL保存于-20℃，提取的DNA保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2PCR擴增引物序列見表1。PCR條件：反應體系(10 μL)包含1×HotStarTaq 緩沖液、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq 聚合酶、1 μL 樣本DNA和1 μL多重PCR引物。反應的熱循環(huán)條件如下：95℃ 2 min預變性；94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃1.5 min，11個循環(huán)；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃1.5 min，24個循環(huán)；最后72℃延伸2 min；4℃保存。

表1　引物

1.3.3PCR產(chǎn)物純化在10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37℃溫浴1 h, 然后75℃滅活15 min。連接引物反應體系：10×連接緩沖液 1 μL、高溫連接酶 0.25 μL、5′連接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′連接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、純化后多重PCR產(chǎn)物 2 μL、ddH2O 6 μL 混勻。取0.5 μL 稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz 500 SIZE STANDARD， 9 μL Hi-Di 混勻， 95℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀。ABI3730XL測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems, USA) 來分析。

2　結果

2.1一般資料的比較3組間年齡、性別以及糖尿病病程差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，3組間糖化血紅蛋白差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，無DR的T2DM組患者糖化血紅蛋白最低，見表2。

表2　一般資料比較(±s)

2.2 VDR基因4個SNPs Hardy-Weinberg平衡檢驗rs1544410、rs7975232、rs2228570及rs731236 位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.001)，見表3。

表3　VDR基因4 SNPs Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 VDR基因4個SNPs基因型與等位基因頻率分布的比較3組VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ酶切位點基因型與等位基因頻率的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中3組VDR基因BsmI酶切位點基因型分布均以C/C型最常見，其次是C/T型，C等位基因頻率較高；TaqI酶切位點基因型分布以A/A型最常見，其次是G/A型，A等位基因頻率較高,見表4。

DR患者與無DR的T2DM患者VDR基因4個SNPs等位基因頻率分布的比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。NPDR患者與PDR患者VDR基因4個SNPs等位基因頻率分布的比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表6。

表43組VDR基因4個SNPs基因型與等位基因頻率分布的比較/例(%)

SNP基因型等位基因NPDR組PDR組T2DM組χ2P值rs1544410 C/T27(14.9)26(17.8)37(14.1)-0.412 C/C154(85.1)118(80.8)224(85.5) T/T0(0.0)2(1.4)1(0.4) C335(92.5)262(89.7)458(92.2)1.9540.380 T27(7.5)30(10.3)39(7.8)rs7975232 C/A71(39.2)48(32.9)106(40.5)2.7760.596 A/A18(9.9)17(11.6)30(11.5) C/C92(50.9)81(55.5)126(48.0) C225(67.8)210(71.9)82(28.1)1.5090.475 A107(32.2)358(68.3)166(31.7)rs2228570 G/A71(39.2)68(46.6)111(42.4)4.9940.294 A/A43(23.8)25(17.1)67(25.6) G/G67(37.0)53(36.3)84(32.0) G205(56.6)174(59.6)279(53.2)3.1880.203 A157(43.4)118(40.4)245(46.8)rs731236 G/A27(14.9)26(17.8)37(14.1)-0.414 A/A154(85.1)118(80.8)224(85.5) G/G0(0.0)2(1.4)1(0.4) G27(7.5)30(10.3)39(7.4)2.3410.312 A335(92.5)262(89.7)485(92.6)

注：理論數(shù)T<1，或者1≤T≤5的格子數(shù)超過總格子數(shù)的1/5，選用Fisher確切概率法。

表5　DR與無DR的T2DM患者VDR基因4個SNPs等位基因頻率分布的比較/例(%)

表6　NPDR組與PDR組患者VDR基因4個SNPs等位基因頻率分布的比較/例(%)

3　討論

DR是一個多階段、多基因疾病，發(fā)病機制復雜。通常認為DR發(fā)生、發(fā)展與糖尿病病程、血糖控制情況等因素有關[5]。然而，臨床中部分病程長且血糖控制欠佳的T2DM患者并未發(fā)生DR，而病程短、血糖控制平穩(wěn)的患者往往已合并嚴重的DR，這主要歸因于不同個體對于相同病因的遺傳易感性不同[6]。因此，研究DR與其相關候選基因的關系及其基因表達差異對早期防治DR有重要的意義。VDR是DR候選基因之一，為親核蛋白，存在單核苷酸多態(tài)性，1,25-二羥基維生素D3是維生素D3的主要活性形式，可與VDR結合，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學效應。研究表明，VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ 4個SNPs基因多態(tài)性與DR密切相關[7]。

新疆當?shù)鼐用耧嬍沉晳T喜好高脂、多鹽以及高糖食物, 少食蔬菜而多食面食, 這樣長期不合理飲食結構的背景形成了新疆本地居民糖尿病及DR高發(fā)的地域特點[8-10]。何菲等[11]研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族男性、女性及總糖尿病患病率標化率均高于維吾爾族。因此，本研究篩選新疆漢族T2DM人群,通過imLDRTM 多重SNP分型試劑盒對589個樣本進行4個SNPs位點分型，檢測VDR 基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ酶切位點的多態(tài)性，分析基因型及等位基因之間分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這與Cyganek等[12]和Capoluongo等[13]研究結果相近。但亦有不同意見者。Tavenrna等[1]研究表明，VDR TaqⅠ基因多態(tài)性是一種與嚴重DR發(fā)生相關的新危險因子。在C肽缺乏的高加索人中，進展期DR與VDR FokⅠ基因多態(tài)性具有相關性[2]。Hong等[3]檢測分析537名T2DM韓國患者的VDR基因BsmⅠ(rs1544410)酶切點的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)等位基因B是T2DM患者發(fā)生DR的低危因素。孫京華等[14]研究表明正常人和DR的患者中，VDR TaqⅠ基因存在多態(tài)性的差異。烏云娜等[15]研究內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族DR與VDR基因FokⅠ多態(tài)性有關聯(lián)性。本研究與諸多學者研究結果不同，考慮原因為VDR基因多態(tài)性存在種族及區(qū)域分布差異，可能與人群生活習慣以及所處地理環(huán)境有關[16]，亦可能與樣本量大小、實驗方法以及篩選研究對象的納入標準和排除標準等不同有關。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DR患者與無DR的T2DM患者、NPDR患者與PDR患者VDR基因4個SNPs等位基因頻率分布的比較差異均無相關性(P>0.05)，故我們認為新疆漢族T2DM人群VDR基因BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ及TaqⅠ 4個SNPs的多態(tài)性與DR的發(fā)生或DR的嚴重程度均無關，這為VDR基因多態(tài)性與DR相關性研究提供了新的實驗依據(jù)。

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(本文編輯張巧蓮)

Association between vitamin D receptor gene polymorphisms in 4 SNPs and diabetic retinopathy of type 2 diabetes mellitus in Han population in Xinjiang

LI Li1, YI Xianglong2, QIAN Yi2, ZHOU Wei2, ZHAO Chunhuan2, MEI Bo2

(1DepartmentofOphthalmology,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo investigate association between BsmⅠ, ApaⅠ, FokⅠ and TaqⅠ polymorphisms in vitamin D receptor (VDR) gene and diabetic retinopathy (DR) of type 2 diabetes mellitus (T2DM) in Han population in Xinjiang. Methods589 patients of T2DM in Han population were screened， including 181 patients with nonproliferative retinopathy (NPDR), 146 patients with proliferative retinopathy (PDR), and 262 patients without diabetic retinopathy. DNA was extracted from blood samples. BsmⅠ, ApaⅠ, FokⅠ and TaqⅠ polymorphisms in VDR gene were genotyped using iMLDR technique. Allele and genotype frequencies were compared among three groups using the χ2test. ResultsThe genotype and allele frequencies of rs1544410, rs7975232, rs2228570 and rs731236 were not different among three groups (P>0.05). ConclusionThere were no correlation between BsmⅠ, ApaⅠ, FokⅠ, and TaqⅠ polymorphisms in VDR gene and DR of T2DM in Han population in Xinjiang.

diabetic retinopathy; Vitamin D receptor; gene polymorphisms

國家自然科學基金(81260150，81560161)； 國家教育部高等學校博士學科點專項科研基金新教師類(20126517120004)； 中國博士后科學基金面上資助項目(2014M562485)； 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院青年科研基金(2012QN08)

李麗(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：眼底疾病診斷與治療。

易湘龍，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，研究方向：眼底病近視矯正及角膜移植，E-mail: xly1010@sina.com。

1,25-二羥維生素D3及其受體基因多態(tài)性在新疆維吾爾族糖尿病視網(wǎng)膜病變患者發(fā)病中作用及機制的研究

R77; R34

A

1009-5551(2016)09-1081-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.001

2016-03-16]

專題研究作者簡介：易湘龍，男，漢族，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師?，F(xiàn)任新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科副主任，中華醫(yī)學會眼科學分會全國青年委員、新疆醫(yī)學會眼科分會常委。2011年獲得中山大學中山眼科中心眼科學博士學位。

從事眼科臨床教學科研工作近15年，熟悉眼科各類疾病的診斷治療，尤其在眼底病的診斷治療、屈光不正的手術矯正、角膜移植等領域具有較豐富的臨床經(jīng)驗。為新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院學科骨干，先后主持國家自然科學基金項目2項，中國博士后科研基金1項，教育部博士點新教師項目1項，中華醫(yī)學會課題1項。發(fā)表SCI論文4篇。2013年被授予新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科技之星稱號。2014年獲得自治區(qū)優(yōu)秀自然科學論文二等獎、新疆醫(yī)科大學青年科技新星稱號，并入選自治區(qū)天山英才工程(第三層次)人才梯隊。2014年度被評為新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院優(yōu)秀帶教老師，現(xiàn)受聘為新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院醫(yī)師規(guī)范化培訓督導專家。

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見和最嚴重的微血管并發(fā)癥, 也是最常見的致盲性眼病之一。易湘龍副教授及其帶領的團隊一直從事活性維生素D3(1,25(OH)2D3)與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病的相關研究，DR發(fā)病原因復雜，越來越多的研究表明DR的發(fā)病與免疫和低度炎性反應有關?；钚?,25(OH)2D3具有免疫調(diào)節(jié)的作用，可通過細胞表面的受體(VDR)對免疫細胞發(fā)揮復雜的調(diào)控作用，如抑制T細胞增殖，抑制炎癥因子的表達，從而減輕或抑制免疫或炎癥反應的發(fā)生。本課題以DR為研究對象，以1,25(OH)2D3及VDR為切入點，探討患者血清中1,25(OH)2D3)表達水平的差異；探討1,25(OH)2D3對DR患者單個核細胞和CD4+T細胞增殖及細胞因子分泌的影響，闡明1,25(OH)2D3)在DR發(fā)病過程中的免疫調(diào)節(jié)作用；探討VDR基因多態(tài)性與DR的相關性，從基因易感性層面揭示其作用。本研究將可能回答免疫反應在DR發(fā)病過程中是否起作用及可能的作用機制，可能為DR的防治提供新的靶點和切入點。