趙　芳, 鄧　瑋, 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學1第六附屬醫(yī)院檢驗科， 2第六附屬醫(yī)院醫(yī)院辦公室, 烏魯木齊　830002, 3基礎醫(yī)學院免疫學教研室， 烏魯木齊　830011)

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共刺激分子(ICOS)及其特異性配體(ICOSL)在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達及其臨床意義研究

趙芳1, 鄧瑋2, 丁劍冰3

(新疆醫(yī)科大學1第六附屬醫(yī)院檢驗科，2第六附屬醫(yī)院醫(yī)院辦公室, 烏魯木齊830002,3基礎醫(yī)學院免疫學教研室， 烏魯木齊830011)

目的研究共刺激分子(ICOS)及其特異性配體(ICOSL)在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(OA)滑膜組織中的表達及其臨床意義。方法分別采集14例OA輕度及18例OA重度患者滑膜病變部位和遠離病變部位，經(jīng)HE染色法觀察其病理改變，免疫組織化學法檢測滑膜組織中ICOS、ICOSL的表達情況。結(jié)果OA輕度患病組和重度患病組滑膜組織病變部位出現(xiàn)明顯的炎性改變。ICOS、ICOSL在OA患者病變滑膜組織中高表達，且重度患病組表達最高。結(jié)論ICOS、ICOSL共刺激分子在OA患者病變滑膜組織中高表達，對炎癥反應的免疫紊亂和免疫損傷發(fā)揮重要作用。

誘導共刺激分子(ICOS); 誘導共刺激分子特異性配體(ICOSL)； 骨性關(guān)節(jié)炎(OA)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteroarthritis，OA)是目前較為常見的骨性關(guān)節(jié)疾病，尤其嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。近年研究發(fā)現(xiàn)，OA患者的免疫細胞和免疫介質(zhì)出現(xiàn)異?，F(xiàn)象[1]。根據(jù)可誘導共刺激分子(ICOS)及其特異性配體(ICOSL)活化后誘導和調(diào)節(jié)免疫反應的特性,推斷ICOS/ICOSL信號可能在OA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用，從而參與OA的免疫損傷和免疫紊亂的調(diào)節(jié)[2]。因此，對ICOS、ICOSL共刺激通路的調(diào)控有望為多種疾病開辟新的免疫方法學治療的途徑。本研究通過使用免疫組織化學法檢測ICOS、ICOSL的表達，以探討OA的發(fā)病過程與正性共刺激分子是否存在關(guān)系，為研究共刺激分子在OA的免疫學發(fā)病機制中可能的作用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1一般資料選擇2015年9月-2015年11月在新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)鏡外科、骨病矯形科、關(guān)節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科住院的OA患者共32例，OA的診斷根據(jù)《膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診療規(guī)范》(2008版)[3]中的標準進行,患者年齡>38歲，無創(chuàng)傷性骨折、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨腫瘤、結(jié)核、化膿及關(guān)節(jié)內(nèi)骨折急性期，其中男性10例，女性22例，平均年齡(60.63±8.62)歲。

1.2儀器與試劑顯微鏡(Leica DM3000)，切片機(Leica RM2135)，Motic Bs顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團公司),兔抗ICOS免疫組化一抗(濃度為1∶150,abcam公司)，兔抗ICOSL免疫組化一抗(濃度為1∶200,北京博奧森有限公司)，免疫組化檢測試劑二抗(北京奧博來科技有限責任公司)。

1.3滑膜組織的采集按Kellgren-Lawrence分期，將Ⅰ級、Ⅱ級患者設為輕度患病組(14例)，Ⅲ級、Ⅳ級設為重度患病組(18例)。分別收集兩組患者行關(guān)節(jié)手術(shù)后的膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病變部位和遠離病變部位(病變與正常組織交界遠離病變部位2 cm處)，病變大小為5 mm×3 mm。置于10%中性甲醛液固定24 h，取出石蠟包埋切片，用于病理學觀察和免疫組織化學檢測。

1.4HE染色觀察將輕度、重度患病組滑膜組織病變部位和遠離病變部位制作的切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察其病理情況。

1.5免疫組化法觀察關(guān)節(jié)滑膜組織中ICOS/ICOSL的表達情況每張滑膜組織切片隨機選取5個不同視野分別采集圖像(100倍)，采用IPP專業(yè)圖像分析軟件得出分布面積(area)、光密度(OD)及累積光密度值(IOD)，進行統(tǒng)計學分析。實驗中設置陽性對照和陰性對照。以試劑公司提供的陽性片染色后作為陽性質(zhì)控，陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。

2　結(jié)果

2.1骨性關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理改變輕度患病組和重度患病組的遠離病變部位滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，可見細胞排列有序，由1～3層滑膜細胞組成，滑膜下層細胞數(shù)量較少?；?nèi)少見淋巴細胞和漿細胞(圖1)。

a： 遠離病變部位滑膜組織b：病變滑膜組織

圖1骨性關(guān)節(jié)炎的病理形態(tài)學檢測(HE×100倍)

2.2輕度患病組和重度患病組滑膜組織不同分級的病理改變輕度患病組病變部位的滑膜經(jīng)HE染色后，可見滑膜組織疏松、細胞水腫，除了淋巴細胞和漿細胞外，滑膜內(nèi)見少量嗜中性粒細胞增生和單核細胞浸潤。重度患病組病變部位的滑膜經(jīng)HE染色后，可見細胞水腫、滑膜組織疏松，除了淋巴細胞和漿細胞外，滑膜內(nèi)大量單核細胞和嗜中性粒細胞增生，滑膜細胞的數(shù)量增多，見疏松結(jié)締組織。出現(xiàn)一些絨毛滑膜增生和纖維素滲出，可見大量血管增生,并且血管周圍有淋巴細胞和纖維增生包裹。滑膜表面形成瘢痕(圖2)。

a： Ⅰ級

c： Ⅲ級

c： Ⅲ級

d： Ⅳ級

圖2膝關(guān)節(jié)滑膜組織按K-L分期的病理改變(HE×100倍)

2.3OA患者滑膜組織中ICOS、ICOSL的表達和分布免疫組織化學分析結(jié)果顯示，滑膜組織中ICOS陽性表達主要位于細胞漿。OA患者滑膜組織可見 ICOS分子的表達，而遠離病變部位的輕度患病組和重度患病組，未見ICOS、ICOSL陽性表達(圖3、4)。輕度患病組、重度患病組的病變滑膜組織中ICOS、ICOSL表達的IOD值高于遠離病變滑膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且重度患病組病變滑膜組織中ICOS、ICOSL表達的IOD升高更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

a： 遠離病變部位滑膜組織ICOS表達

b： 遠離病變部位滑膜組織ICOSL表達

c： 病變滑膜組織ICOS表達

d ：病變滑膜組織ICOSL表達

圖3輕度患病組滑膜組織ICOS/ICOSL的免疫組化表達情況(×100倍)

a： 遠離病變部位滑膜組織ICOS表達

b： 遠離病變部位滑膜組織ICOSL表達

c： 病變滑膜組織ICOS表達

d ：病變滑膜組織ICOSL表達

圖4　重度患病組滑膜組織ICOS/ICOSL的免疫組化表達情況(×100倍)

注：與遠離病變部位滑膜組織比較，*P<0.05; 與輕度患病組比較，△P<0.05。

3　討論

關(guān)于ICOS在OA的發(fā)病中的作用少有報道。張衛(wèi)東等[4]對近10年文獻數(shù)據(jù)進行分析，OA與類風濕性關(guān)節(jié)炎之間存在很大的相關(guān)性。Smith等[5]運用免疫組織化學方法和傳統(tǒng)的組織學染色研究骨性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織學變化。王婷等[6]采用流式細胞術(shù)和RT-PCR的方法檢測患者外周血淋巴細胞表面共刺激分子ICOS和ICOSL的表達,發(fā)現(xiàn)其與類風濕性關(guān)節(jié)炎具有相似性。本研究顯示，OA患者的滑膜組織中均可見ICOS 和 ICOSL 出現(xiàn)陽性高表達，提示ICOS和ICOSL分子可能也參與了骨性關(guān)節(jié)炎的局部炎癥反應。

早期的研究表明ICOS、ICOSL信號通路可促進Th1和Th2相關(guān)細胞因子的釋放，通過研究類風濕性關(guān)節(jié)炎， Grave′s 病、重癥肌無力和狼瘡性腎炎等自身免疫病發(fā)現(xiàn)，ICOS、ICOSL 共刺激通路主要在 T 細胞應答的效應階段發(fā)揮作用。ICOS、ICOSL共刺激通路的調(diào)控與自身免疫病的發(fā)病機制和進程關(guān)系密切[7]。機體免疫系統(tǒng)在正常生理情況下，具有識別“自我”的能力，因而對自身的組織細胞成分不會產(chǎn)生免疫應答，或者產(chǎn)生免疫應答及其微弱，但是如出現(xiàn)某些病理情況，機體的自身的免疫耐受遭到破壞，致使機體的免疫系統(tǒng)對自己的組織細胞成分視為“異己 ”，從而產(chǎn)生免疫應答反應[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的滑膜組織中可見ICOS 和 ICOSL 的陽性表達，明顯高于遠離病變部位，并且根據(jù)OA患病的程度而發(fā)生變化，因此ICOS 和 ICOSL可能在骨性關(guān)節(jié)炎的免疫紊亂機制中起著介導炎癥反應發(fā)生的作用。共刺激分子ICOS、ICOSL在OA患者滑膜組織中表達呈陽性，考慮可能是ICOS 和 ICOSL 信號通路過度誘導引起T 淋巴細胞的活化 ，從而導致了慢性炎癥反應的免疫紊亂和免疫損傷。

本研究中，ICOS、ICOSL在遠離病變滑膜組織中不表達，但是在骨性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中出現(xiàn)陽性表達，并且重度患病組的表達更強，提示ICOS、ICOSL陽性表達情況與骨性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)生程度存在關(guān)系，其發(fā)生的機制有待進一步研究。

共刺激信號的分子結(jié)構(gòu)明顯不同，ICOS 和 ICOSL 主要在免疫效應階段發(fā)揮正性共刺激信號分子的作用。本研究采用免疫組織化學檢測技術(shù)觀察共刺激分子ICOS、ICOSL 在OA患者滑膜組織中的表達情況，研究結(jié)果顯示ICOS、ICOSL共刺激分子在OA患者病變滑膜組織中高表達，對炎癥反應的免疫紊亂和免疫損傷發(fā)揮重要作用，為骨性關(guān)節(jié)炎的治療尋找可能的新靶點。

[1]宋維亞，厲小梅，李向培.T細胞在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用[J].安徽醫(yī)藥，2010，14(4):476-478.

[2]李盛村，王婷，王國祥.ICOS/ICOSL的免疫調(diào)節(jié)作用與相關(guān)疾病的研究進展[J].基礎醫(yī)學與臨床，2014,34(10)：1434-1437.

[3]王秀義，王文強，王文軍，等.膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)診療規(guī)范[C]//中華中醫(yī)藥學會針刀醫(yī)學分會二〇〇八年度學術(shù)會議.2008.

[4]張衛(wèi)東,戴剛,楊柳,等.近10年滑膜相關(guān)疾病研究的文獻計量學分析[J].重慶醫(yī)學, 2006, 35(4):316-321.

[5]Smith SC, Folefac VA, Revell PA, et al. An immunocytochemical study of the distribution of proline-4-hydroxylase in normal, osteoarthritic and rheumatoid arthritic synovium at both the light and electron microscopic level[J].Br J Rheumatol,1998,37(3):287-291.

[6]王婷,蔣覺安,胡筱涵,等.ICOS/ICOSL在類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細胞的表達及臨床意義[J].中國免疫學雜志,2015，31(3)：369-374.

[7]王青松,厲小梅.阻斷ICOS/ICOSL途徑用于治療自身免疫性疾病的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,7(31):985-988.

[8]李盛村,王婷,王國祥.ICOS/ICOSL的免疫調(diào)節(jié)作用與相關(guān)疾病的研究進展[J].基礎醫(yī)學與臨床,2014,34(10):1434-1437.

(本文編輯楊晨晨)

Research on the expression of ICOS, ICOSL stimulus molecule in the Osteroarthritis synovial tissue with its clinical significance

ZHAO Fang1, DENG Wei2, DING Jianbing3

(1DepartmentofLaboratory,2HospitalOffice,TheSixthAffiliatedHospital,Urumqi830002,China;3DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo research on the expression of ICOS, ICOSL stimulus molecule in the synovial tissue of osteroarthritis (OA) patientsand its clinical significance. MethodsSynovial tissue lesions and distant sites of 14 cases of mild illness groups and 18 cases of severe illness group were collected to take HE staining. Immunohistochemistry were used to detect the expression of ICOS, ICOSL. ResultsOA synovial tissue of patients had pathological changes. ICOS, ICOSL were highly expressed in OA patients, and severe illness group had the highest expression level with the change of the disease varies. ConclusionThe level of ICOS，ICOSL significantly increased in OA synovial tissue of patients might be due tochronic inflammation immune disorders and immune injury. Keywords: induced by stimulating molecules (ICOS); inducible co stimulator ligand (ICOSL); osteoarthritis

新疆醫(yī)科大學科研創(chuàng)新基金(XJC2013223)

趙芳(1981-)，女，碩士，主管檢驗師，研究方向：自身免疫學。

丁劍冰，女，教授，博士生導師，研究方向：免疫學，E-mail：331044524@qq.com。

R684.3

A

1009-5551(2016)09-1128-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.012

2016-05-12]