賈　輝　顏　鳴　王作君　馬宏達(dá)

(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng)，110016)

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補(bǔ)正續(xù)骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

賈輝顏鳴王作君馬宏達(dá)

(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng)，110016)

目的：建立并完善軍規(guī)制劑補(bǔ)正續(xù)骨丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對(duì)處方中5味具有顯微鑒別特征的藥味進(jìn)行鑒別；對(duì)方中續(xù)斷、何首烏、骨碎補(bǔ)、雞血藤、菟絲子運(yùn)用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別；樣品中柚皮苷的含量測(cè)定則運(yùn)用專屬性較強(qiáng)的HPLC法進(jìn)行定量測(cè)定。色譜條件：色譜柱為Welchrom C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(20∶80)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：25 ℃。結(jié)果：顯微鑒別特征明顯，薄層定性鑒別的斑點(diǎn)清晰，分離效果良好；柚皮苷在2.5～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1.0000)，平均加樣回收率為96.06%，RSD為1.63%(n=6)。結(jié)論：本次研究所建立和完善的標(biāo)準(zhǔn)在方法上專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好；在操作上簡(jiǎn)便易行，省時(shí)省力。符合軍隊(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的要求，可作為該制劑列入新版軍規(guī)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

補(bǔ)正續(xù)骨丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；柚皮苷；HPLC；TLC

補(bǔ)正續(xù)骨丸由何首烏、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、雞血藤等11味中藥組成，具有補(bǔ)肝腎，活血脈，強(qiáng)筋壯骨，舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)除濕，消腫止痛之功效，主要用于治療骨質(zhì)增生，頸椎綜合征，腰肌勞損、腰酸腿痛等。依據(jù)2013軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題的總體要求，我們從校對(duì)制劑處方、明確制劑工藝各詳細(xì)參數(shù)、增加薄層鑒別藥味及建立健全含量測(cè)定項(xiàng)等各個(gè)方面對(duì)原軍規(guī)制劑補(bǔ)正續(xù)骨丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升，力求該制劑經(jīng)此研究之后，質(zhì)控水平與現(xiàn)行中國(guó)藥典同步。本課題在修訂原標(biāo)準(zhǔn)何首烏、菟絲子薄層鑒別的基礎(chǔ)上，增加了續(xù)斷、骨碎補(bǔ)和雞血藤的薄層鑒別；建立了方中骨碎補(bǔ)中指標(biāo)性成分柚皮苷的含量測(cè)定。該軍規(guī)制劑標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)本次提高完善后，質(zhì)量穩(wěn)定，條件可控，更能保證患者安全用藥。

1　一般資料

高效液相(泵型號(hào)W600，紫外檢測(cè)器型號(hào)2487，Waters公司)。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201312)；續(xù)斷對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121033-201311)；大黃素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110756-200110)；雞血藤對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121173-201103)；菟絲子對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121232-201102)；補(bǔ)正續(xù)骨丸(沈陽(yáng)軍區(qū)司令部門診部，批號(hào)：20140220、20140625、20141120)；水為重蒸水(本單位自制)，乙腈(色譜級(jí)，F(xiàn)isher公司)，甲醇(色譜級(jí)，F(xiàn)isher公司)，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別1)雞血藤：草酸鈣簇晶，方晶較多，大小懸殊，稀有更大簇晶，呈不規(guī)則形，少數(shù)小方晶只10 μm左右，見圖1-1。導(dǎo)管多為具緣紋、網(wǎng)紋導(dǎo)管，見圖1-4。2)何首烏：?jiǎn)瘟５矸哿Ｃ黠@可見，類球形粒，臍點(diǎn)呈星狀或三叉狀，見圖1-2。3)合歡：晶纖維粗大，見圖1-3。石細(xì)胞多成群、成無色或淡黃色、長(zhǎng)方形或類圓形，見圖1-5。4)鹿茸：鏡下可見的顯微結(jié)構(gòu)如：毛茸碎片，表面多為薄而透明的扁平細(xì)胞，見圖1-6。5)狗脊：鏡下可見的顯微結(jié)構(gòu)如：金黃色的非腺毛，見圖1-7，1-8。

圖1　補(bǔ)正續(xù)骨丸顯微鑒別圖(10×100倍)

注：1.簇晶(雞血藤);2.淀粉粒(何首烏);3.晶纖維(合歡);4.導(dǎo)管(雞血藤);5.石細(xì)胞(合歡);6.毛茸碎片(鹿茸);7.金色非腺毛(狗脊);8.金色非腺毛(狗脊)。

2.2薄層鑒別

2.2.1續(xù)斷1)取補(bǔ)正續(xù)骨丸10 g，剪刀剪碎后研缽研細(xì)，加入40 mL分析甲醇，經(jīng)30 min超聲提取，過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)褂谜麴s水30 mL溶解，水飽和正丁醇振搖提取，每次20 mL，重復(fù)3次，正丁醇液合并，用正丁醇飽和的1% NaOH堿液20 mL洗滌，重復(fù)2次，棄去堿液，再用正丁醇飽和的水20 mL洗滌1次，棄水液，正丁醇液通風(fēng)櫥揮干，加乙醇1.0 mL溶解殘?jiān)吹霉┰嚻啡芤篬1]。取0.5 g續(xù)斷對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。取續(xù)斷陰性樣品蜜丸，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述三種溶液各3 μL，點(diǎn)于一塊硅膠G薄層板，用(4∶1∶5)比例的正丁醇-醋酸-水的上層溶液[2]展開完畢后，通風(fēng)櫥晾干，噴灑10%硫酸乙醇溶液，110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜與對(duì)照藥材斑點(diǎn)的色譜行為一致，陰性樣品色譜無干擾。見圖2A。

2.2.2何首烏取補(bǔ)正續(xù)骨丸15 g，剪刀剪碎后研缽研細(xì)，加入80 mL分析甲醇，經(jīng)超聲處理40 min，過濾，濾液水浴蒸干，加蒸餾水20 mL溶解，用乙酸乙酯20 mL提取，重復(fù)3次，乙酸乙酯液合并，合并液水浴揮干，加甲醇1.0 mL使殘?jiān)芙?，即得供試品溶液[3]。取大黃素對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度1 mg/mL的對(duì)照品溶液。取何首烏陰性樣品蜜丸，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品和陰性樣品溶液各5 μL、對(duì)照品溶液2 μL，點(diǎn)于一塊硅膠G薄層板，用(20∶2∶1)比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸展開完畢后，通風(fēng)櫥晾干，日光下檢視。供試品色譜與對(duì)照品斑點(diǎn)的色譜行為一致，顯同樣的黃色斑點(diǎn)，經(jīng)氨氣熏蒸后斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，且陰性樣品色譜無干擾。見圖1B。

2.2.3骨碎補(bǔ)取補(bǔ)正續(xù)骨丸5 g，剪刀剪碎后研缽研細(xì)，加入20 mL分析甲醇，經(jīng)30 min超聲處理，過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)?0 mL蒸餾水溶解，用20 mL乙酸乙酯提取1次，分離乙酸乙酯液水浴揮干，加甲醇1.0 mL使殘?jiān)芙?，即得供試品溶液。取柚皮苷?duì)照品，加甲醇制成濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。取骨碎補(bǔ)陰性樣品蜜丸，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述三種溶液各10 μL，點(diǎn)于一塊硅膠G薄層板，用(1∶12∶2.5∶3)比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水的上層溶液[4]展開完畢后，通風(fēng)櫥晾干，噴灑三氯化鋁試液顯色，置365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜與對(duì)照品斑點(diǎn)的色譜行為一致，且陰性樣品色譜無干擾。見圖2C。

2.2.4雞血藤取補(bǔ)正續(xù)骨丸10 g，剪刀剪碎后研缽研細(xì)，加入30 mL乙酸乙酯，經(jīng)30 min超聲處理后過濾，濾液水浴揮干，加甲醇1.0 mL使殘?jiān)芙?，即得供試品溶液。?.5 g雞血藤對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。取雞血藤陰性樣品蜜丸，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述三種溶液各5 μL，點(diǎn)于一塊硅膠G薄層板，用(30∶1)比例的二氯甲烷-甲醇展開完畢后，通風(fēng)櫥晾干，置254 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜與對(duì)照藥材斑點(diǎn)的色譜行為一致，且陰性樣品色譜無干擾。見圖2D。

2.2.5菟絲子取補(bǔ)正續(xù)骨丸10 g，剪刀剪碎后研缽研細(xì)，加入30 mL石油醚，經(jīng)40 min超聲處理后，靜靜放置5 min后，傾倒出石油醚液，丟棄，殘?jiān)猛L(fēng)櫥揮干石油醚，加入60 mL甲醇，再次超聲處理40 min后濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水使溶解，乙酸乙酯20 mL提取，重復(fù)2次，乙酸乙酯液合并，水浴揮干，殘?jiān)?.0 mL甲醇使溶解，即得供試品溶液[5]。取1 g菟絲子對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。取菟絲子陰性樣品蜜丸，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述三種溶液各2 μL，點(diǎn)于一塊硅膠G薄層板，用(40∶30∶10∶7)比例的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水的下層溶液展開完畢后，通風(fēng)櫥晾干，噴灑三氯化鋁試液顯色，置365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜與對(duì)照藥材斑點(diǎn)的色譜行為一致，且陰性樣品色譜無干擾。見圖2E。

圖2　補(bǔ)正續(xù)骨丸TLC圖

注：A.續(xù)斷；B.何首烏；C.骨碎補(bǔ)；D.雞血藤；E.菟絲子。

2.3含量測(cè)定

2.3.1色譜條件色譜柱品牌為Welchrom C18柱，內(nèi)徑與柱長(zhǎng)為(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相組成為乙腈-水(20∶80)；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為283 nm[6]；流速設(shè)定為1 mL/min；柱溫設(shè)定：25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算高于3 000。

2.3.2溶液制備1)對(duì)照品溶液：柚皮苷對(duì)照品放置于干燥器中減壓干燥12 h以上后取適量，精密稱定，加入適量甲醇使溶解，制成濃度為30 μg/mL的柚皮苷對(duì)照品溶液。2)供試品溶液：取補(bǔ)正續(xù)骨丸2 g，剪刀剪碎后研缽研細(xì)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入40 mL 30%甲醇，稱定重量，水浴加熱回流提取1 h，放冷，再次稱定重量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，離心(10 080 r/min)5 min，離心后取上清液2.5 mL置于10 mL容量瓶中，用30%甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得。3)陰性樣品溶液：取骨碎補(bǔ)陰性樣品蜜丸，按照供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3.3專屬性試驗(yàn)精密吸取制備好的供試品、對(duì)照品、陰性樣品3種溶液各20 μL，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果補(bǔ)正續(xù)骨丸供試品色譜與柚皮苷對(duì)照品色譜樣品峰色譜行為一致，且陰性樣品溶液不干擾主樣品峰的測(cè)定。柚皮苷峰保留時(shí)間約為15 min，分離度、對(duì)稱度、拖尾因子均符合要求，理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算高于3 000。試驗(yàn)表明此法專屬性強(qiáng)。結(jié)果見圖3。

圖3　柚皮苷HPLC色譜圖

注：A.陰性溶液；B.供試品；C.對(duì)照品；1：柚皮苷。

2.3.4線性關(guān)系考察將柚皮苷對(duì)照品配制成濃度為2.5、5、10、20、40、80 μg/mL的溶液，精密吸取各溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為柚皮苷6個(gè)進(jìn)樣濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)為各進(jìn)樣濃度所測(cè)峰面積值，所得回歸方程：y=33 772x+7 853，r=1.000 0(n=6)。結(jié)果顯示，柚皮苷濃度在2.5～80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，所測(cè)補(bǔ)正續(xù)骨丸樣品落在線性范圍之中。

2.3.5儀器精密度考察柚皮苷對(duì)照品溶液，精密吸取20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定柚皮苷峰面積，計(jì)算RSD為0.15%。表明實(shí)驗(yàn)所用HLPC精密度良好。

2.3.6樣品穩(wěn)定性考察制備補(bǔ)正續(xù)骨丸供試品溶液一份(批號(hào)：20140220)，室溫放置，在0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)柚皮苷定峰面積。計(jì)算RSD為1.47%。表明補(bǔ)正續(xù)骨丸供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7方法重復(fù)性考察取補(bǔ)正續(xù)骨丸樣品(批號(hào)：20140220)6份，按供試品溶液制備方法制備并測(cè)定含量。計(jì)算得柚皮苷平均含量為1.204 2 mg/g，RSD為2.36%(n=6)。表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8回收率考察精密稱取已測(cè)知含量的補(bǔ)正續(xù)骨丸(批號(hào)：20140220)6份，每份約1 g，精密稱定，分別定量加入柚皮苷對(duì)照品，按供試品溶液方法制備，測(cè)定分析并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1　柚皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9樣品含量測(cè)定取3批補(bǔ)正續(xù)骨丸樣品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算補(bǔ)正續(xù)骨丸中柚皮苷含量。見表2。

表2　樣品中柚皮苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3.10含量限度的確定根據(jù)對(duì)補(bǔ)正續(xù)骨丸三批中試樣品的含量測(cè)定，確定了該制劑的含量限度：本品每1 g含骨碎補(bǔ)以柚皮苷(C19H18O11)計(jì)，不得少于1.0 mg。

3　討論

本制劑處方有11味藥材，原標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)何首烏、菟絲子2味藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別，但二者重現(xiàn)性均較差。本研究在修訂何首烏、菟絲子薄層鑒別的基礎(chǔ)上，增加了續(xù)斷、骨碎補(bǔ)和雞血藤的薄層鑒別，經(jīng)多次驗(yàn)證，五味藥材的薄層鑒別方法專屬性及重復(fù)性均良好。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，依據(jù)參考文獻(xiàn)的方法，本課題對(duì)供試品溶液制備的提取方式、提取溶劑、提取溶劑用量、提取時(shí)間等涉及到的諸多影響因素進(jìn)行了考察和比較。對(duì)色譜條件中的流動(dòng)相選擇也進(jìn)行了不同比例的篩選，以求柚皮苷樣品峰的分離度、對(duì)稱度及拖尾因子均達(dá)到理想效果，理論板數(shù)合格，最終選擇了乙腈-水(20∶80)做為流動(dòng)相，該流動(dòng)相系統(tǒng)配制簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，且陰性不干擾柚皮苷主峰的測(cè)定。

本試驗(yàn)所建立的補(bǔ)正續(xù)骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從定性、定量2個(gè)方面共同驗(yàn)證，力求工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可靠，方法簡(jiǎn)潔，操作順暢。最終通過對(duì)多批補(bǔ)正續(xù)骨丸樣品中柚皮苷含量的反復(fù)測(cè)定，分析計(jì)算，我們?cè)O(shè)定了該制劑的含量限度，以此作為該制劑今后實(shí)際檢驗(yàn)工作的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，也為該制劑藥效學(xué)研究的開展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]許保海,臧琛,聶其霞.關(guān)節(jié)痛丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,18(3):65-67.

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(2015-08-26收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Quality Standard Study on Buzheng Xugu Pill

Jia Hui,Yan Ming,Wang Zuojun,Ma Hongda

(DepartmentofPharmacyofGeneralHospitalofShenyangMilitaryCommandArea,Shenyang110016,China)

Objective:To establish a quality standard for Buzheng Xugu pill.Methods:Five crude drugs in the prescription were identified by microscope,including Duanxu (Radix Dipsaci),Heshouwu (Polygonum multiflorum),Gusuibu (Rhizoma Drynariae),Jixueteng (Caulis Spatholobi) and Tusizi (Semen Cuscutae) were identified by TLC method.Also,the content of Naringin in Buzheng Xugu pill was determined by HPLC.The Welchrom C18(200 mm×4.6 mm,5 μm) column was used.The mobile phase consisted of acetonitrile-water (20:80) was at a flow rate of 1.0 mL/min,and the detection wavelength was at 283 nm under 25 ℃.Results:The microscopic features were easy to identify:the spots in the thin layer chromatography were clear.The Naringin showed a good linear relationship within the range of 2.5～80 μg/mL ( r=1.0000).The average recovery was 96.06%,and theRSDwas 1.63%(n=6).Conclusion:This method is simple,reliable,reproducible and can be used in the quality control of the preparation of the drug.

Buzheng Xugu pill; Quality standard; Naringin; HPLC; TLC

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題——遼沈地區(qū)預(yù)防治療常見軍事訓(xùn)練傷醫(yī)院制劑的標(biāo)準(zhǔn)提升研究(編號(hào)：14ZJZ13-1)

賈輝(1982.12—)，中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，藥師，碩士，研究方向：中藥學(xué)，Tel：(024)28851751，E-mail：smockingandy@163.com

馬宏達(dá)(1976.09—)，男，博士，主管藥師，研究方向：藥劑學(xué)，Tel：(024)28851750，E-mail：mahongdamahongda@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.054