阿拉坦敖日格樂 包勒朝魯 薩礎(chǔ)拉 那生桑
(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院,呼和浩特,010110; 2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,呼和浩特,010110)
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蒙藥草烏十二味片質(zhì)量控制研究
阿拉坦敖日格樂1包勒朝魯1薩礎(chǔ)拉2那生桑1
(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院,呼和浩特,010110; 2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,呼和浩特,010110)
目的:建立蒙藥草烏十二味片的顯微、薄層鑒別方法和高效液相含量測定方法,并通過急性毒性實驗考察用藥安全性,建立其質(zhì)量控制方法。方法:在顯微鏡下觀察,以晶纖維、菊糖、草酸鈣針晶、大型導(dǎo)管、厚壁細胞為指標(biāo),鑒別本品中寬筋藤、土木香、茜草、接骨木、訶子肉;以土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯為對照品,點樣于硅膠G薄層板上,環(huán)己烷-乙酸乙酯-氯仿(10∶1∶1)展開,鑒別本品中的土木香;以大葉茜草素為對照品,點于硅膠G薄層板上,乙醚(60~90 ℃)-丙酮(4∶1)展開,鑒別本品中的茜草;HPLC法對茜草中大葉茜草素進行含量監(jiān)控,用ODS色譜柱,甲醇-水-四氫呋喃(310∶90∶3)為流動相,在250 nm波長下測定;取小鼠40只,最大給藥量(22.5 g/kg)灌胃1 d(相當(dāng)于臨床用藥334.87倍),連續(xù)觀察14 d。結(jié)果:方法可有效鑒別本品中寬筋藤、土木香、茜草、接骨木、訶子肉等5味藥材,HPLC法在0.16~1.6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9997),大葉茜草素的平均回收率為103.1%,RSD1.11%,含量限度為不得少于0.035%;觀察14 d后小鼠無死亡現(xiàn)象,狀態(tài)良好。結(jié)論:方法可有效控制本品質(zhì)量;本品毒性很小,臨床應(yīng)用安全可靠(>100倍)。
草烏十二味片;定性鑒別;含量測定;急性毒性實驗;質(zhì)量控制
草烏十二味蒙文名“泵阿-12”,是由制草烏、寬筋藤、土木香、茜草、接骨木、訶子肉等12味藥材組成。為內(nèi)蒙古阿拉善盟特戈熙甲狀腺病蒙醫(yī)研究院在臨床上使用40余年的經(jīng)典經(jīng)驗方,處方最初記載于蒙醫(yī)經(jīng)典著作《甘露四部》[1]。具有清熱解表,消“粘”,止痛功能。臨床上主要用于疼痛性亞甲炎,流感,上呼吸道感染,扁桃體炎,淋巴結(jié)腫,乳腺腫痛,免疫力低下等癥,尤其對疼痛性亞甲炎的治療效果顯著。但目前還沒任何機構(gòu)對其開展過質(zhì)量控制等相關(guān)研究,本研究為提升該制劑質(zhì)量控制水平,增加了顯微鑒、薄層鑒別等常規(guī)檢查項和HPLC含量測定方法,還通過動物實驗考察了其臨床用藥安全性。
1.1受試藥物草烏十二味片,由內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司生產(chǎn)(批號:130601,130602,130603)。
1.2實驗動物昆明品種小白鼠,雌雄各半,體重(20±2)g,由內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心提供,動物合格證號:8806M35,許可證號:SCXK(蒙)2002-0001,清潔度為國家二級。實驗室溫度20~23 ℃,相對濕度70%。
1.3儀器島津SCL-10AVP高效液相色譜儀,CLASS-VP工作站,Phenomenex Kromasil 5 μ 100A C18色譜柱(250×4.60 mm 5 μ micron,229087-12);梅特勒-托利多AB135-S天平;JA5003N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司);Motic BA210生物顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司);HH-S8電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);KQ250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.4試藥土木香內(nèi)酯對照品(110760-201209);異土木香內(nèi)酯對照品(110761-200204)土木香對照藥材(121090-201002);大葉茜草素對照品(供含量測定用,110884-200604);茜草對照藥材(121049-201003)。均由中國食品藥品檢定研究院提供。色譜甲醇(美國Fisher Scientific公司,型號:A452-4,批號FL-07-0896);色譜四氫呋喃(天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司);水為市售娃哈哈牌純凈水;硅膠G薄層板(青島海浪硅膠干燥劑廠),其他試劑均為分析純。
2.1顯微鑒別取本品,置顯微鏡下觀察:具纖維周圍薄壁細胞含方晶形成晶纖維(寬筋藤);菊糖眾多,無色,呈不規(guī)則碎塊狀(土木香);草酸鈣針晶存在于薄壁細胞中或散在(茜草);具緣紋孔的大型導(dǎo)管(接骨木);纖維狀的厚壁細胞交錯排列(訶子肉)。見圖1。
2.2薄層鑒別
2.2.1土木香取本品粉末7 g,加甲醇50 mL,密塞,振搖,超聲30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品液。另取土木香對照藥材與土木香藥材各0.5 g,加甲醇4 mL同方法制成對照藥材溶液和藥材溶液。再取缺土木香陰性樣品7 g,按供試品液制法制陰性對照液。再分別精密稱取土木香內(nèi)酯對照品和異土木香內(nèi)酯對照品適量,加甲醇制濃度為2 mg/mL的溶液,作對照溶液。參照《中華人民共和國藥典》(2010年版一部)附錄V IB試驗,吸取上述六種溶液各吸取5 μL,分別點于同一硅膠G板,展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-氯仿(10∶1∶1),展開,取出,晾干,噴以5%茴香醛硫酸乙醇溶液,在105 ℃下加熱至斑點的顯色清晰。供試品色譜上,在與對照藥材、藥材及2種對照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的藍紫色斑點,陰性對照在此位置無干擾[2]。見圖2。
圖1 草烏十二味片顯微鑒別
注:1.寬筋藤具纖維周圍薄壁細胞含方晶形成晶纖維;2.土木香的菊糖眾多,無色,呈不規(guī)則碎塊狀;3.茜草的草酸鈣針晶存在于薄壁細胞中或散在;4.接骨木具緣紋孔的大型導(dǎo)管;5.訶子肉纖維狀的厚壁細胞交錯排列。
圖2 土木香薄層色譜圖
注:1~3.三批供試品;4.陰性對照品;5.土木香內(nèi)酯對照品;6.異土木香內(nèi)酯對照品;7.土木香對照藥材;8.土木香藥材。
2.2.2茜草取本品粉末7 g,加甲醇20 mL,密塞,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試液。另取茜草的對照藥材和茜草藥材各0.5 g,同上法制備對照藥材液和藥材液。再取缺茜草的陰性樣品7 g,按供試液制法制成陰性對照組溶液。再精密稱取大葉茜草素的對照品適量,加甲醇至制成含量為2.5 mg/mL的對照品液。參照《中華人民共和國藥典》(2010年版一部)附錄VIB試驗,吸取上述三種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙醚(60~90 ℃)-丙酮(4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。在紫外光燈的365 nm處檢視。供試品的色譜上,在與對照藥材色譜和對照品相應(yīng)的位置上,顯相同的藍綠色熒光亮斑,陰性對照在此位置無干擾[3-4]。見圖3。
圖3 茜草薄層色譜圖
注:1~3.三批供試品;4.陰性對照品;5.大葉茜草素對照品;6.茜草對照藥材;7.茜草藥材。
2.3含量測定
2.3.1色譜條件Phenomenex Kromasil 5 μ 100 A C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm,229087-12);流動相甲醇-水-四氫呋喃(310∶90∶3),檢測波長為250 nm,流速為1 mL/min。在此色譜條件下,大葉茜草素與其他組分色譜峰的達基線分離,峰型良好,理論塔板數(shù)大于4 000[5]。
2.3.2對照品溶液的制備精密稱取大葉茜草素對照品適量,置棕色瓶中,加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液,即得。
2.3.3供試品溶液的制備取本品粉末約3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,浸泡過夜,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3.4專屬性考察處方中除去茜草,按原制劑比例制備陰性對照品,照供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。吸取上述溶液各20 μL,分別按色譜條件進行分析,結(jié)果陰性樣品無干擾。見圖4。
圖4 草烏十二味片HPLC
注:A.對照品;B.陰性對照;C.供試品;1.大葉茜草素。
2.3.5線性關(guān)系考察取上述大葉茜草素對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL,注入高效液相色譜儀,按色譜條件分析,測定各自峰面積,以對照品含量為縱坐標(biāo),峰面積為橫坐標(biāo),求得回歸方程Y=3 908 290.428 1X+8 981.079 5(r2=0.999 7),結(jié)果表明大葉茜草素在0.16~1.6 μg范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。
2.3.6精密度試驗精密吸取供試品(批號130601)溶液20 μL,連續(xù)進樣6次,測定樣品中大葉茜草素峰面積,結(jié)果測得峰面積的RSD1.85%,證明儀器精密度良好。
2.3.7穩(wěn)定性試驗精密取同一批號的供試品(批號130601)溶液20 μL,分別在0、2、4、6、8 h測定樣品中大葉茜草素的含量,結(jié)果測得含量(%)的RSD為1.46%,表明供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.8重復(fù)性試驗取供試品(批號130601)6份,分別制備6份供試品溶液,精密吸取20 μL,測定大葉茜草素的含量,結(jié)果測得含量(%)的RSD為0.81%(n=6),表明本方法重現(xiàn)性良好。
2.3.9加樣回收率試驗取供試品(批號130601)粉末,精密稱取0.6 g,共6份,分別精密加入對照品溶液3.4 mL,精密加入甲醇10 mL,按供試品溶液的制備方法制備,測定大葉茜草素的含量,結(jié)果平均回收率為103.1%,RSD為1.11%,表明本方法準確可靠。見表1。
表1 加樣回收實驗結(jié)果表
2.3.10含量測定及含量限度的確定取三批(130601,130602,130603)供試品溶液,精密吸取20 μL,測定大葉茜草素的含量,結(jié)果測得平均含量為0.0416%。考慮到實際生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)移率差別、不同批次藥材的質(zhì)量差異等因素,定本品大葉茜草素含量不得低于0.035%[6-10]。
2.4急性毒性試驗根據(jù)中藥新藥研究指導(dǎo)原則[11-12],對本品進行了小鼠急性毒性實驗觀察。
2.4.1預(yù)試驗取小鼠8只,雌雄各半,以小鼠能承受最大濃度和最大體積(0.6 mL/20 g)灌胃2次/d,本品后24 h內(nèi)無死亡。受藥物濃度和體積限制,無法測出其LD50。
2.4.21 d最大給藥量測定取小鼠40只,雌雄各半,隨機分為對照組、給藥組,每組20只。禁食12 h,以本品可灌胃最大濃度和最大體積(0.6 mL/20 g)藥量2次/d,間隔時間為6 h,總給藥量22.5 g生藥/kg體重,相當(dāng)于臨床用藥量的334.87倍(臨床用藥量4.3 g生藥/(人· d),對照組灌胃等容量0.5%CMC-Na水溶液。按下式計算小鼠的最大給藥量的臨床計量倍數(shù)。
給藥組20只小白鼠灌胃給藥后4~5 min活動量減少,腹脹,24 h后上述表現(xiàn)消失,毛發(fā)光潔,鼻、眼、口腔未發(fā)現(xiàn)有異常分泌物,活動、飲食和糞便未見異常,未出現(xiàn)死亡情況。試驗結(jié)束時處死后經(jīng)肉眼觀察主要臟器未見明顯的異常改變,與對照組相比沒有明顯的異常。表明本品對小鼠的一般狀況及臟器沒有明顯的影響。14 d后體重(31.58±3.46)g,與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組小白鼠精神狀態(tài)佳,毛色白而有光澤,大小便正常,無死亡。結(jié)果表明本品毒性很小,臨床應(yīng)用安全可靠(>100倍)。
制草烏為本品君藥,但在含量測定研究表明本品在制劑中的含量過小,故無法建立其鑒別和含量測定項。本方中重要成分之一的茜草有清傷熱和血熱,止血,止瀉之功效[13],不僅與本品清熱解表,消“粘”,止痛功能和治療免疫力低下等癥的主治內(nèi)容基本吻合[14-15],而且其鑒別和含量測定方法成熟,穩(wěn)定。故以大葉茜草素為對照品,對本品進行了鑒別和含量測定研究。本研究所建立的方法不僅能簡單、有效地控制該品質(zhì)量,還充分證明了該藥臨床用藥的安全可靠性。
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(2014-12-08收稿責(zé)任編輯:張文婷)
Quality Control Research of Mongolian Medicine Caowu Shi′erwei Tablets
Altanorgil1, Bolchulu1, Sachula2, Nasensang1
(1MongolianMedicineResearchInstituteofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China;2MongolianMedicineCollegeofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China)
Objective:By establishing microscopic identification, TLC(thin-layer chromatography) and HPLC(high performance liquid content) determination methods as well as an acute toxicity experiment to examine the safety of Wucao Shi′erwei and to form its quality criterion.Methods:To identify the content of Kuanjinteng, Tumuxiang, Qiancao, Jiegumu, Hezirou in Caowu Shierwei tablets by counting crystal fiber, inulin, calcium oxalate crystal needle, large ducts, thick-walled cells under microscope. Tumuxiang was identified by TCL with cyclohexane-acetic ether-chloroform(10∶1∶1) as an agent to observe the content of alantolactone and isoalantolactone. Qiancao was identified by TCL with diethyl (60~90 ℃)-acetone(4:1) as an agent with the content of Rubimaillin being its measure standard. The procedure of HPLC was performed on the chromatographic column of ODS, and the mobile phase in the gradient elution was methanol-water-tetrahydrofuran (310: 90:3). The detection wavelength was 250 nm. Giving rats Wucao Shi′erwei for 14 days, once a day (22.5 g /kg, 334.87 times of the clinical standard) to observe its safety.Results:The method is effective in identifying Kuanjinteng, Tumuxiang, Qiancao, Jiegumu, and Hezi. Rubimaillin showed a good linear relationship at a range from 0.16 to 1.6 μg (r2=0.9997). The average recovery was 103.1%,RSD=1.11%, and the determination limit is smaller than 0.035%. No death of rats were observed during 14 days of experiment.Conclusion:This method can be used for the quantitative deternmination of Mongolian Medicine Caowu Shi′erwei tablets. Besides, the toxicity of Caowu Shierwei tablets is small and could be used in clinical treatment.
Mongolian Medicine Caowu Shierwei tablets; Quanlitative identification; Content determination; Acute toxicity test; Quality control
內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙中藥重點實驗室提升計劃項目資助課題(編號:20090902)
阿拉坦敖日格樂(1984.02—),男,碩士,助教,研究方向:從事蒙藥質(zhì)量標(biāo)準化研究,E-mall:orgile@sina.cn
那生桑(1956.01—),男,博士,教授,研究方向:從事蒙藥質(zhì)量標(biāo)準化及炮制規(guī)范化研究,E-mail:nasang56@sina.com
R284.1
A
10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.055