孫寶瑩　郭　濤　李西文　陳士林　孫　奕

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700； 2 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州，730050)

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中藥研究

葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究

孫寶瑩1,2郭濤2李西文1陳士林1孫奕1

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700； 2 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州，730050)

目的：制備葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。方法：藥材經(jīng)DNA條形碼基原鑒定，均為豆科植物葛根Puerarialobata(willd.)Ohwi的干燥根。采用水煎煮的方法制備葛根飲片的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并考察葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑中葛根素含量測定的色譜條件，對不同地區(qū)的葛根水煎液進行指紋圖譜測定，并分別計算葛根素的轉(zhuǎn)移率和葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率。結(jié)果：通過對10批不同產(chǎn)地葛根的標(biāo)準(zhǔn)湯劑及其飲片樣品進行測定，葛根素轉(zhuǎn)移率范圍為54.3%～79.1%，出膏率范圍為19.0%～38.5%；同時對10批葛根飲片制作出相應(yīng)的指紋圖譜，標(biāo)定了5個共有峰，計算出其相似度在94%以上。結(jié)論：10批次不同產(chǎn)地的葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑與葛根飲片的基本屬性相一致，建立本研究的葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法規(guī)范，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

葛根;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);指紋圖譜

葛根是2015版《中華人民共和國藥典(一部)》收載品種[1]，為豆科植物Puerarialobata(willd.)Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛[2]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、辛，性平，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉之功[3]。葛根具有增加腦及冠狀動脈血流量、降低血管阻力、降血糖及解熱等多種功效[4-6]。葛根中的有效成分主要包括異黃酮類(如葛根素、大豆苷元、大豆苷等)、葛根苷類、三萜皂苷類及生物堿類等[7-10]，一般以葛根素、大豆苷等含量較高的異黃酮類成分來評價葛根的質(zhì)量[11]。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以飲片投料，用水為溶媒加熱提取，以物理方法分離、濃縮后所得到的中藥飲片水煎劑。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑需要充分考慮藥材來源、工藝及質(zhì)量控制等各個環(huán)節(jié)的影響因素，以達到與飲片的基本屬性相一致的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12]。我們的研究遵循了《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中所制訂的標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的方法[13]，對10批不同產(chǎn)地的葛根制備了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，進行了10批葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測定和指紋圖譜研究，并考察了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率和有效成分葛根素的轉(zhuǎn)移率。

1　材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；WRX-1S型BP110S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

葛根素(含量≥98%，批號S90068)，購自北京索萊寶科技有限公司。葛根購自河北省安國藥材市場和安徽省亳州藥材市場。見表1。甲醇為色譜純(美國Fisher)，水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

表1　樣品來源及基原鑒定

2　方法與結(jié)果

2.1基原鑒定每批次葛根基原鑒定檢測按藥材和飲片取樣法(《中華人民共和國藥典》附錄IIA)取樣，采用天根植物基因組試劑盒提取DNA，ITS2序列擴增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR擴增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35～40個循環(huán)；72 ℃，10 min。使用DNA測序儀(ABI，3730)對目的條帶進行雙向測序，PCR擴增引物作為測序引物。序列拼接采用CodonCode Aligner，將獲得的序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http://www.tcmbarcode.cn)中應(yīng)用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法進行結(jié)果比對，同時與《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》中的葛根ITS2標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對。

測序后拼接序列經(jīng)2種方法判定，結(jié)果顯示10批次樣品均為豆科植物Pueraria lobata(willd.)Ohwi的干燥根。葛根檢測序列如下。

CACATCGTTACCCCAACGCAAACAGACGTCCCACA

CGACGGCCGTTGCGTGGTAGGGTGCACGCTGACCT

CCCGCGAGCGGCGTCTCGCGGTTGGTTGAAAATCG

AGTTCGCGGCCGAGCACGCCGTGATAAAATGGTGG

ATGAGCAACGCTCGAGACCAATCACGCGCTGCGA

CTCGGTCCGCGAAGGACTCCCTGATTGATGACGAC

CCTACAGTGCGCCTCCTCTCCGGAGACGCTCTCTA

CGAGA。

2.2對照品溶液的制備取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成含葛根素0.08 mg/mL的對照品溶液。置冰箱中，4 ℃保存，備用。

2.3供試品溶液的制備

2.3.1葛根飲片樣品溶液制備精密稱取表1中各批次葛根飲片粉末0.1 g，按照2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的方法制備各樣品溶液。

2.3.2葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備精密稱取表1各批次葛根飲片100 g，分別加入7倍量的水，先浸泡30 min，然后加熱回流提取30 min，趁熱過濾(200目篩網(wǎng))，分離出煎煮液后，藥渣再加入6倍量的水回流提取20 min，趁熱過濾(200目篩網(wǎng)),合并2次煎煮液，濃縮成500 mL溶液，即濃度為0.2 g/mL的葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.3.3葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備供試品的制備取2.3.2項下制得的葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑搖勻，取該濃縮液1 mL至50 mL的容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，即得供試品，進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.4色譜條件色譜柱為Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為0.2%冰醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫：0—5 min,15% B；5—23 min，15%～40% B；23—28 min，40% B；28—46 min，40%～70% B，46—56 min，70%～95% B，56—60 min，95%～95% B，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長為250 nm。

2.5方法學(xué)研究

2.5.1線性關(guān)系考察精密吸取上述對照品貯備液2、4、6、8、10 μL，分別按2.3中所述色譜條件測定各成分的峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X)進行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為Y=6 316.375 0 x+3.900 0，R2=0.999 9。實驗表明，葛根素的進樣濃度在0.16～0.64 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖1。

圖1　葛根素表標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2精密度考察精密吸取2.3.3項下的同一供試品溶液適量，按照2.4色譜條件進樣，連續(xù)6次，結(jié)果平均峰面積為5 727.4，測定并計算葛根素峰面積的RSD值為0.1%，表明儀器精密度良好。見表2。

2.5.3穩(wěn)定性試驗精密吸取2.3.3項下的同一供試品溶液適量，制備供試品溶液，按照2.4色譜條件進樣，分別于配制后的0、4、8、10、12、24 h進樣，測定并計算葛根素平均峰面積為5 673.3，RSD值為0.4%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表3。

表2　精密度試驗結(jié)果

表3　穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5.4重復(fù)性試驗精密量取同一批次葛根素標(biāo)準(zhǔn)湯劑6份，按照2.4色譜條件進樣，測定并計算葛根素平均峰面積為5 787.02，RSD值為0.6%。實驗表明本方法重復(fù)性良好。見表4。

表4　重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5.5加樣回收率試驗精密稱取6份相同的樣品，分別精密加入等量葛根素對照品溶液1 mL(濃度為0.11 mg/mL)，按供試品溶液制備方法制備，按照上述色譜條件測定含量，結(jié)果葛根素的平均回收率為97.0%，RSD值為1.64%。見表5。

表5　加樣回收率試驗結(jié)果

2.6轉(zhuǎn)移率及出膏率考察

2.6.1葛根樣品中葛根素含量測定按照2015版《中華人民共和國藥典》制備各樣品溶液，分別精密吸取各溶液10 μL進樣。按照2.4色譜條件測定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計算葛根素含量，結(jié)果見表6。

2.6.2葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中葛根素含量測定分別精密吸取2.3.1中供試品溶液各10 μL進樣，按照2.4色譜條件測定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計算葛根素含量，結(jié)果見表6。

表6　葛根素在葛根飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的含量

2.6.3葛根素出膏率與轉(zhuǎn)移率1)葛根素出膏率計算精密稱取葛根水煎液10 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱干燥3 h，取出后置干燥器中冷卻30 min，稱重，計算出膏率，結(jié)果見表7。2)葛根素轉(zhuǎn)移率計算根據(jù)2.6.2項下測定的葛根飲片和葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的葛根素含量，由以下公式計算葛根素轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表7。

表7　葛根素的出膏率與轉(zhuǎn)移率(%)

2.7葛根HPLC指紋圖譜共有模式的建立及主要色譜峰的辨認(rèn)根據(jù)10批葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜，建立了其對照指紋圖譜(圖)，共標(biāo)定了5個峰；對照品色譜圖，見圖2中，顯示出3′-羥基葛根素(峰1)、葛根素(峰2)、3-甲氧基葛根素(峰3)、大豆苷(峰4)、大豆苷元(峰5)色譜峰的保留時間和峰面積，選擇葛根素為參照峰，計算各峰的相對保留時間和峰面積比值(表8)。10批葛根標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度大于95%(圖3和表9)。

圖2　葛根對照品HPLC指紋圖譜

圖3　10批葛根樣品HPLC指紋圖譜表8　各對照品及其保留時間

編號物質(zhì)名稱保留時間/min13'-羥基葛根素13.132葛根素16.2333-甲氧基葛根素17.134大豆苷17.645大豆苷元19.10

表9　共有峰相對保留時間和相對峰面積(見圖3)

3　討論

1)本文對10批不同產(chǎn)地的葛根制備了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并考察了葛根飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量，藥材中葛根素的含量從2.89%～4.58%，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。同時，對葛根素等5個成分進行了含量測定與指紋圖譜分析。實驗結(jié)果表明，葛根的標(biāo)準(zhǔn)湯劑與其飲片具有屬性的一致性。

2)葛根素是《中華人民共和國藥典》規(guī)定的葛根飲片測量指標(biāo)成分，含葛根素(C21H20O9)不得少于2.4%，而且能夠被水提取出來，產(chǎn)率較為穩(wěn)定，因而本文以葛根素作為標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分，用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和成分轉(zhuǎn)移率的評價。

3)評價工藝的穩(wěn)定性，出膏率和指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率的建立作為相應(yīng)的評價質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由研究結(jié)果可以看出出膏率范圍為19.0%～38.5%，平均值為32.30%，幅度變化范圍為5.52%；葛根素轉(zhuǎn)移率范圍為58.19%～79.14%，平均值為67.75%，幅度變化范圍為8.18%。實驗表明，本文所選用飲片具有較好的代表性。如果生產(chǎn)過程中沒有進行嚴(yán)格的控制，可能會導(dǎo)致出膏率和成分轉(zhuǎn)移率變化范圍較大。因而，對于工業(yè)化的中藥飲片產(chǎn)品，其應(yīng)嚴(yán)格控制生產(chǎn)過程，使其出膏率和成分轉(zhuǎn)移率范圍在正常范圍內(nèi)。

本文按照《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》的有關(guān)闡述[13]，明確相應(yīng)工藝參數(shù)，建立了葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝；經(jīng)研究所建立的葛根飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法與臨床應(yīng)用一致、質(zhì)量穩(wěn)定，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可靠，可以在實際中推廣應(yīng)用。

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(2016-04-12收稿責(zé)任編輯：洪志強)

Preparation and Quality Standard Study on the Kudzuvine Root Standard Decoction

Sun Baoying1,2, GuoTao2, Li Xiwen1, Chen Shilin1, Sun Yi1

(1InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China；2LanZhouUniversityofTechnology,SchoolofLifeScienceandEngineering,Lanzhou730050,China)

Objective: To prepare standard decoction and to study the quality standards of Kudzuvine Root. Methods: The medicinal medica was evaluated by DNA bar code to make sure the medica was Kudzuvine Root′s dry root. The The method of standard decoction preparation of Kudzuvine Root and its determination of chromatogram conditions were adopted so as to determine the fingerprint of standard decoction and calculate the transfer rate and the extractum rate of the standard decoction. Results: After the measurement of standard decoction of 10 batches of Kudzuvine Root from different regions and sample pieces, the transfer rate ranged from 54.3% to 79.1% and extractum rate was at the range of 19.0%～38.5%; Moreover, the 10 batches of Kudzuvine Root produced the corresponding fingerprint, 5 common peaks were calibrated, and the similarity was more than 94%. Conclusion: The basic properties of 10 batches of Kudzuvine Root Decoction are consistent with its prepared herbal medicine standard. Therefore, it can be used to establish the standard decoction of Kudzuvine Root.

Kudzuvine Root; Quality standard; Standard decoction; Fingerprint

中國中醫(yī)科學(xué)院綜合性大平臺項目(編號：Z2014003)

孫奕，博士，副研究員，研究方向：主要從事天然活性成分、中藥分析等研究，電話(010)64021051，E-mail：ysun@icmm.ac.cn

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.053