王丹丹　宋寧寧　亢春彥　陳建中

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院乳腺外科　鄭州　450014　2)河南醫(yī)學高等?？茖W校病理教研室　新鄭　451191

?

常山酮聯(lián)合拉帕替尼對乳腺癌腦轉移的抑制作用研究

王丹丹1)宋寧寧1)亢春彥2)陳建中1)

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院乳腺外科鄭州4500142)河南醫(yī)學高等?？茖W校病理教研室新鄭451191

目的探討常山酮聯(lián)合拉帕替尼對乳腺癌腦轉移的抑制作用。方法以人乳腺癌細胞MDA-MB-231及BALB裸鼠分為溶劑組、拉帕替尼組、常山酮+拉帕替尼組。首先通過體外實驗，以MTT法及劃痕試驗觀察各組MDA-MB-231增殖及遷移能力；然后制備乳腺癌腦轉移模型，通過神經(jīng)功能評分及腦部HE染色觀察各組腦轉移情況。結果拉帕替尼顯著抑制了MDA-MB-231的增殖及遷移能力，并減少了MDA-MB-231向腦部的定植作用。常山酮顯著增強了拉帕替尼的治療效果。 結論常山酮聯(lián)合拉帕替尼能夠顯著提升拉帕替尼對乳腺癌腦轉移的抑制作用。

乳腺癌；腦轉移；常山酮；拉帕替尼

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。隨著近年治療技術的進步，乳腺癌患者的生存期逐漸延長，腦轉移的發(fā)生率有所增加。25%～30%的乳腺癌表達人表皮生長因子受體(humanepidermalgrowthfactor2，HER2)，該受體參與調控腫瘤細胞增殖和遷移，其過度表達不僅與乳腺癌的惡化程度呈正比，且與腦轉移密切相關[2]。目前，大多抗癌藥物不能通過血腦屏障(bloodbrainbarrier，BBB)，導致乳腺癌腦轉移后生存期極低，1a生存率<20%[3]。因此尋找能夠通過BBB的抗癌藥物對乳腺癌腦轉移的治療有重要臨床意義。

拉帕替尼為一種小分子HER1及HER2抑制劑，已有研究證實該藥能夠通過BBB到達顱內，對乳腺癌腦轉移有較好的治療效果，目前已成為乳腺癌腦轉移的一線藥物之一；常山酮為新型光譜抗球蟲藥，能夠通過BBB，對結腸癌、白血病及乳腺癌等發(fā)揮抗癌作用[4]。本研究旨在探討常山酮聯(lián)合拉帕替尼對乳腺癌腦轉移的治療效果，以發(fā)現(xiàn)、提高治療乳腺癌腦轉移的藥物與方法。

1　材料與方法

1.1實驗材料及分組裸鼠(BALB/c-nu/nu，雌性，6周齡，體質量16～22g)購于南京大學模式動物研究所，人乳腺癌細胞MDA-MB-231購于美國ATCC公司，DMEM、胎牛血清均購于Hyclone公司，MTT試劑盒購于中國康為試劑公司，常山酮等化學試劑購于Sigma公司。本實驗分為3組：溶劑組、拉帕替尼組、常山酮+拉帕替尼組。

1.2細胞活性測定將人乳腺癌細胞MDA-MB-231以1×104/孔的密度接種于24孔板，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后分別加入DMEM、拉帕替尼(終濃度為0.5μM)及常山酮(終濃度為100nM)培養(yǎng)48h。之后將培養(yǎng)液吸出，加入MTT(最終濃度62.5μg/mL)，在37 ℃培養(yǎng)4h，之后吸出上層液體，加入DMSO后將上清取出，使用分光光度計在570nm波長下觀察吸收值，以測定各組細胞增殖能力。每組重復8次。

1.3細胞遷移能力測定本實驗使用劃痕試驗測定不同組別遷移能力。首先將MDA-MB-231細胞接種于24孔板，待細胞生長至90%左右，使用200μL槍頭在各組培養(yǎng)孔底部自上而下畫一條豎線，然后依據(jù)組別加入DMEM、拉帕替尼(終濃度為0.5μM)及常山酮(終濃度為100nM)。將培養(yǎng)板置于37 ℃條件下培養(yǎng)24h。使用倒置顯微鏡拍照，并通過ImageJ軟件計算各組劃痕兩側細胞之間的平均距離。每組重復8次。

1.4乳腺癌腦轉移模型制作依據(jù)Kunal等[5]方法制作乳腺癌腦轉移模型[5]：通過腹腔注射水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒后打開胸腔，在左心室注射1.75×105MDA-MB-231人乳腺癌細胞，之后依次縫合傷口，于5周后通過改良的神經(jīng)功能評分(mNSS)觀察裸鼠神經(jīng)功能體征及腦部切片HE染色的方式觀察乳腺癌腦轉移情況。其中溶劑組不做任何處理，拉帕替尼組在注射MDA-MB-231細胞同時以100mg/kg劑量腹腔隔天注射拉帕替尼5周，常山酮+拉帕替尼組則在注射MDA-MB-231細胞同時分別以50mg/kg及100mg/kg的劑量隔天腹腔注射拉帕替尼及常山酮5周。每組各12只。

2　結果

2.1不同組別細胞增殖情況拉帕替尼(0.5μM)顯著抑制了MDA-MB-231細胞的增殖作用，常山酮(100nM)顯著增強了拉帕替尼抑制MDA-MB-231細胞增殖作用的療效。見表1。

表1　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231細胞增殖作用的影響

注：與溶劑組相比，*P<0.05；與拉帕替尼組相比，#P<0.05

2.2不同組別遷移能力變化比較拉帕替尼(0.5μM)顯著抑制了MDA-MB-231細胞的遷移能力，常山酮(100nM)顯著增強了拉帕替尼抑制MDA-MB-231細胞增殖作用的療效。見表2。

表2　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響±s)

注：與溶劑組相比，*P<0.05；與拉帕替尼組相比，#P<0.05

2.3不同組別乳腺癌轉移情況mNSS神經(jīng)功能評分及腦部HE染色顯示，制備乳腺癌腦轉移模型時同時處理拉帕替尼(100mg/kg)顯著抑制了MDA-MB-231細胞定植于腦部的能力，常山酮(50mg/kg)顯著增強了拉帕替尼抑制MDA-MB-231向腦部定植能力的療效。見表3。

表3　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231向腦部定植能力的影響

注：與溶劑組相比，*P<0.05；與拉帕替尼組相比，#P<0.05

3　討論

乳腺癌腦轉移作為乳腺癌患者終末期比較常見的轉移癌類型，因多數(shù)常規(guī)抗腫瘤藥物不能通過血腦屏障而導致治療困難，目前臨床上多采用全腦放療加化療的方式改善患者癥狀[6]。乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)腦轉移后存活率極低，因此積極尋找能夠通過血腦屏障的高效抗癌藥物對預防及治療乳腺癌腦轉移具有重大的現(xiàn)實意義。如前所述，25%～30%的乳腺癌表達HER2，該受體與乳腺癌惡化及轉移密切相關；拉帕替尼為一種小分子HER1及HER2抑制劑，已有研究證實，其能夠順利通過血腦屏障到達顱內乳腺癌轉移灶，并通過阻斷HER2受體顯著減小轉移灶體積，提示拉帕替尼可能預防并治療乳腺癌腦轉移[7]。但近期研究提示，拉帕替尼可能會誘導乳腺癌的抗藥性，進而導致治療失敗。因此如何提高拉帕替尼的治療效果、短期高效的抑制腦轉移灶的活性尤為重要。

常山酮為中藥提取物，前期主要應用于家禽類的抗球蟲治療[7]。但近十幾年來，國內外學者發(fā)現(xiàn)其能通過抑制MMPs蛋白、TGF系列通路等明顯抑制結腸癌、血液系統(tǒng)腫瘤及乳腺癌的生長，并可以通過血腦屏障，提示其可能為腦部原發(fā)性腫瘤及轉移性腫瘤的潛在藥物[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼在體外能夠顯著抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖活性及遷移能力，且在制備乳腺癌腦轉移模型時應用可以顯著減少乳腺癌細胞向腦部的定植作用。常山酮不僅能夠提高拉帕替尼抑制MDA-MB-231增殖及遷移的能力，而且與拉帕替尼合用可以大幅度提升拉帕替尼防治乳腺癌細胞向腦部定植的能力。本研究結果說明，拉帕替尼能夠抑制乳腺癌細胞向腦部定植能力，但合用常山酮可以大幅度提升治療效果，可能為治療乳腺癌腦轉移新的治療手段。但常山酮通過何種機制促進拉帕替尼的治療效果尚需進一步深入研究。

[1]杜鐵橋，王永利，于盛會，等.北京市女性乳腺癌危險因素與乳腺癌相關性的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17(1)：5-8.

[2]王建東，王全勝，白熠洲，等.mTOR信號通路在乳腺癌拉帕替尼耐藥細胞系中的作用[J].中華醫(yī)學雜志，2013，93(24)：1 915-1 917.

[3]王濤，江澤飛，宋三泰，等.拉帕替尼等治療乳腺癌腦轉移全腦放療后再復發(fā)1例[J].中華醫(yī)學雜志，2009，89(4)：286-287.

[4]JinML，ParkSY，KimYH，etal.Halofuginoneinducestheapoptosisofbreastcancercellsandinhibitsmigrationviadownregulationofmatrixmetalloproteinase-9[J].IntJOncol，2014，44(1)：309-318.

[5]TaskarKS，RudrarajuV，MittapalliRK，etal.LapatinibdistributioninHER2overexpressingexperimentalbrainmetastasesofbreastcancer[J].PharmRes，2012，29(3)：770-781.

[6]MarshallDA，DealK，BombardY，etal.Howdowomentrade-offbenefitsandrisksinchemotherapytreatmentdecisionsbasedongeneexpressionprofilingforearly-stagebreastcancer?Adiscretechoiceexperiment[J].BMJOpen，2016，6(6)：e010 981.

[7]PinesM，SpectorI.Halofuginone-themultifacetedmolecule[J].Molecules，2015，20(1)：573-94.

[8]PinesM.Halofuginoneforfibrosis，regenerationandcancerinthegastrointestinaltract[J].WorldJGastroenterol，2014，20(40)：14 778-14 786.

[9]YoungSL，Al-HendyA，CoplandJA.Potentialnonhormonaltherapeuticsformedicaltreatmentofleiomyomas[J].SeminReprodMed，2004，22(2)：121-30.

[10]StreeterEH，HarrisAL.Angiogenesisinbladdercancer--prognosticmarkerandtargetforfuturetherapy[J].SurgOncol，2002，11(1/2)：85-100.

(收稿2016-03-21)

R-332

B

1673-5110(2016)16-0121-02