李　橋，張紹勇，仇輝康，陳　明，葉玉珠，袁　媛（.浙江省景寧畬族自治縣林業(yè)局，浙江 景寧 500；.浙江農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安00；.浙江省縉云縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 縉云400）

6種藥劑林間注干施藥防控松材線蟲效果分析

李橋1，張紹勇2，仇輝康2，陳明3，葉玉珠1，袁媛1
（1.浙江省景寧畬族自治縣林業(yè)局，浙江 景寧 323500；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安311300；3.浙江省縉云縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 縉云321400）

為研究注干施藥預(yù)防松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的效果，以6種松材線蟲藥劑林間注干，測定了施藥2 a內(nèi)的防治效果。采用高效液相色譜（HPLC）測定了各藥劑主要有效成分注干后3個(gè)月和1 a的在樹體殘留動(dòng)態(tài)，并利用松材線蟲恒溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條精準(zhǔn)檢測了注藥后死亡松樹體內(nèi)松材線蟲數(shù)量。結(jié)果表明：6種注干藥劑林間防治后，對松材線蟲防治效果存在顯著差異（P＜0.05），各種注干藥劑在注干2 a后將馬尾松Pinus massoniana的死亡率控制在0.4%～4.4%，以甲維鹽、阿維菌素、啶蟲脒為主要成分的藥劑注干防治效果在80%以上；藥后1 a高效液相色譜（HPLC）抽檢測定的樹體內(nèi)各藥劑均有殘留（枯死松樹中未檢測到），其中甲維鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，平均為（0.15±0.11）mg·kg－1。檢測注藥后死亡松樹體內(nèi)均有松材線蟲，且平均至少為897.34條·g－1，說明能在樹體內(nèi)傳導(dǎo)的注干藥劑均有一定的防效及持效期，可在林間推廣和應(yīng)用。表3參24

森林保護(hù)學(xué)；松材線蟲；藥劑防治；注干藥劑；殘留檢測；林間效果

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus是目前國際公認(rèn)的檢疫對象，能引起林業(yè)上的最具毀滅性病害——松材線蟲病［1－2］，其原產(chǎn)于北美地區(qū)，但在中國和日本造成的損失最為嚴(yán)重［3－4］。在傳入中國的30多年中，此病迅速蔓延，國內(nèi)外學(xué)者、林業(yè)技術(shù)人員等對其防治手段進(jìn)行不斷探索與實(shí)踐，但至今尚未找到根除松材線蟲病的方法［5］。在眾多松材線蟲病的防治方法中，注干施藥是一種有效、安全的防治技術(shù)，對未感病松樹進(jìn)行藥劑注干能夠起到很好的預(yù)防效果，特別適合于重點(diǎn)風(fēng)景名勝、自然文化遺產(chǎn)等地區(qū)的松材線蟲病的防治，在害蟲種群的有效控制和保護(hù)天敵方面發(fā)揮著重要作用［5－6］。對于注干藥劑的篩選，國內(nèi)外學(xué)者也做了大量研究，其中日本、葡萄牙等都開發(fā)預(yù)防松材線蟲病的注射針劑［6－7］。進(jìn)入21世紀(jì)，中國加大了對松材線蟲病防治藥物的篩選研究［8－11］，取得了系列成果。在實(shí)際應(yīng)用中，林茂松等［12］引入日本2%阿維菌素針注射試驗(yàn)，證明的確能預(yù)防松材線蟲病。賈進(jìn)偉［13］研究了甲維鹽注干對松材線蟲病的預(yù)防和治療效果表明，提前注干預(yù)防對松材線蟲的效果達(dá)100%；線蟲侵染樹體后20 d注藥，治療效果僅為20%，林間試驗(yàn)注藥預(yù)防1次，可連續(xù)3 a將馬尾松Pinus massoniana的死亡率控制在1%以下，說明注干防治可在一定程度上防控松材線蟲的發(fā)生與傳播。本研究選取市場上應(yīng)用較多的6種藥劑，進(jìn)行其林間防治效果試驗(yàn)并比較分析，采用高效液相色譜測定了松樹體內(nèi)各藥劑主要有效成分的殘留量，并利用松材線蟲恒溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條檢測試劑盒測定了注藥前后死亡松樹體內(nèi)是否含有松材線蟲。試驗(yàn)結(jié)果為松材線蟲的有效防控提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1供試儀器

Waters 600-2998高效液相色譜儀（Waters Symmetry C18 250×4.6×5 μm），SPE凈化柱（C18，Vac 3 cc/200 mg），美國Waters公司生產(chǎn)；IKA RV10基本型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中國廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司生產(chǎn)；超聲波清洗儀KQ-500，中國昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；搖擺式萬能高速粉碎機(jī)，中國溫嶺市林大機(jī)械有限公司生產(chǎn)；CGD-8側(cè)掛式電動(dòng)打孔機(jī)，中國臨沂華森林業(yè)藥械有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

松材線蟲恒溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條檢測試劑盒及相關(guān)配件，中國杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2供試藥劑

甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%），阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%），中國浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%），中國鄭州綠康化工有限公司生產(chǎn)；苦參堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%），中國西安瑞仁生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；甲醇、乙腈等試劑為色譜純，其他試劑均為分析純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

6種注干藥劑分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的阿維菌素微膠囊懸浮劑（A），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的甲維鹽松材線蟲注干防治劑（B），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2%的阿維菌素注干劑（C），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的啶蟲脒注干劑（D），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的甲維鹽松材線蟲注射液（E），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的苦參堿松材線蟲疫苗注射液（F）。均購買自市場（鑒于行業(yè)關(guān)系，不提供生產(chǎn)廠家）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1林間防治試驗(yàn)注干試驗(yàn)地于浙江省景寧畬族自治縣沙灣鎮(zhèn)仙姑村3，4，11和12號小班松材線蟲病發(fā)生區(qū)，為獨(dú)立山頭，共計(jì)33.3 hm2，距村1 000 m，屬純馬尾松林，平均樹高15 m，平均胸徑20 cm，密度1 050株·hm－2左右。將試驗(yàn)地隨機(jī)劃分為8塊標(biāo)準(zhǔn)樣地，標(biāo)準(zhǔn)樣地0.67 hm2，樣地間距大于500 m。其中6種注干藥劑各1塊，清理及不清理枯死松樹處理各1塊作為對照。除清理枯死松樹對照標(biāo)準(zhǔn)樣地（僅2013年1月10日清理）外，其他試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)樣地不進(jìn)行枯死松樹處理（2012年9月至2015 年1月）。于2013年1月10日注干藥劑標(biāo)準(zhǔn)樣地選擇500株健康馬尾松樹按照廠家使用要求注干施藥（50 mL·株－1），藥劑注干部位距離地面松樹基部10 cm處，注干后用紅色噴漆進(jìn)行編號標(biāo)記并在冊記錄，清理枯死松樹和不清理枯死松樹對照區(qū)分別選擇500株健康馬尾松進(jìn)行標(biāo)記并編號。注藥當(dāng)日（2013年1月10日），分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)7塊標(biāo)準(zhǔn)樣地（除清理枯死松樹對照樣地）的松樹枯死數(shù)量，并分別于2014 年1月10日和2015年1月10日調(diào)查8塊標(biāo)準(zhǔn)樣地中，標(biāo)記500株馬尾松樹的死亡數(shù)量。

1.3.2松樹體內(nèi)各藥劑殘留量測定①樣品采集：用高枝剪勾取注藥3個(gè)月和1 a后的相同試驗(yàn)馬尾松主干樹枝5段（至少50 cm長），每種注干藥劑取樣30株樹，其中每標(biāo)準(zhǔn)樣地中死亡馬尾松樹全部取樣，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自然陰干，粉碎機(jī)打成細(xì)小木屑后備用。②樣品提取和凈化［13］：稱取備用木屑100.0 g 于1 000 mL三角瓶中，加入300 mL V（丙酮）∶V（水）=1∶1混合液，震蕩提取30 min，重復(fù)3次，過濾去除殘?jiān)蠛喜⑻崛∫海?0℃水浴減壓濃縮至干，用10 mL V（甲醇）∶V（水）=80∶20混合液溶解，2 000 轉(zhuǎn)·min－1離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，待凈化。采用C18-SPE柱凈化，分別用5 mL的V（甲醇）∶V（水）=80∶20混合液活化和平衡小柱，取1 mL待凈化提取液上樣，然后用20 mL甲醇淋洗3次后（上樣和洗脫過程中流速保持1 mL·min－1），收集洗脫液150 mL圓底燒瓶中，無水硫酸鎂干燥30 min后，40℃水浴減壓濃縮至干，用1 mL甲醇溶解殘留物后待高效液相色譜（HPLC）檢測。③樣品殘留量檢測分析：各種藥劑的分析方法參考下列國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)并加以改進(jìn)：甲維鹽和阿維菌素參照SNT 2114－2008《進(jìn)出口水果和蔬菜中阿維菌素殘留量檢測方法 液相色譜法》測定，啶蟲脒參照GB/T 23584－2009《水果、蔬菜中啶蟲脒殘留量的測定》進(jìn)行測定，苦參堿參照文獻(xiàn)［14］的方法測定。采用外標(biāo)法將各藥劑將配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 mg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照分析方法中注干藥劑的儀器色譜條件進(jìn)行測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。④添加回收率：將未注藥的空白木段，陰干，粉碎，30℃下烘箱烘干至質(zhì)量不再變化，每20 g空白木屑中添加一定量的藥劑標(biāo)準(zhǔn)品，將空白木屑中藥劑添加水平調(diào)整到分別為0.05 mg·kg－1，重復(fù)3次，按上述①②③順序方法對樣品進(jìn)行提取、凈化，測定添加回收率。

1.3.3枯死松樹松材線蟲陽性及含量檢測將樣地中注干后所有死亡松樹進(jìn)行取樣、線蟲分離并統(tǒng)計(jì)松材線蟲含量，利用松材線蟲恒溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條檢測試劑盒進(jìn)行陽性檢測、結(jié)果讀判。結(jié)果描述及判定標(biāo)準(zhǔn)為：陰性：僅在質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)1條紅線，表示樣品中無松材線蟲。陽性：出現(xiàn)2條紅線，1條檢測線，1條質(zhì)控線，表示樣品中存在松材線蟲。無效：無紅色線條出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效或一次性核酸檢測裝置損壞，使用原樣本重新擴(kuò)增和檢測。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1藥劑注干后防治效果

表1　各種藥劑防治效果Table 1　Control effect of different trunk injections in forest

林間各處理防治效果見表1。由表1可知：與不清理死樹對照區(qū)相比，各種注干藥劑施藥對松材線蟲病的防治效果顯著，均與對照組差異顯著（P＜0.05）。各注干藥劑在注干2 a后將馬尾松的死亡率控制在0.4%～4.4%，防治效果為58.49%～96.23%；6種防治藥劑中，3.0%甲維鹽注干防治劑、3.2%阿維菌素注干劑、5.0%啶蟲脒注干劑防治效果較好，1 a后其注干標(biāo)準(zhǔn)樣地松樹死亡率分別為0.4%，0.8%和0.6%，防治效果均大于82.61%，藥后2 a其防治效果均大于86.79%，與其他幾種處理有顯著性差異（P＜0.05）；1.0%阿維菌素微膠囊懸浮劑及1.0%甲維鹽注射液的防治效果大于79.25%；0.3%苦參堿疫苗注射液較差。清理死樹對照也有一定的效果，松樹死亡率分別僅為2.0%和4.0%，不清理死樹對照樣地的馬尾松死亡率最高，2 a后高達(dá)10.6%，與整片林地防治前的平均死亡率相當(dāng)（約為10.0%）。

2.2松樹體內(nèi)各藥劑殘留量

采用高效液相色譜測定了各藥劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，添加回收率均在85%以上。6種藥劑有效成分在藥后3個(gè)月和1 a在樹體內(nèi)均能被檢測到（表2）。其中，5.0%啶蟲脒注干劑與3.0%甲維鹽注干防治劑在藥后3個(gè)月檢測，樹體內(nèi)殘留藥劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為（5.67±1.07）和（2.65±0.35）mg·kg－1；而在藥后1 a，3%甲維鹽注干防治劑、1.0%甲維鹽注射液在樹體內(nèi)殘留質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為（0.95±0.11）和（0.15± 0.04）mg·kg－1，說明各藥劑能在樹體內(nèi)有一定的持效期。對藥后死亡松樹進(jìn)行藥劑殘留量檢測，所有藥劑均未被檢測到。

表2　各種藥劑注干后樹體內(nèi)后藥劑殘留量Table 2　Residue of different trunk injections in pine tree

2.3枯死松樹松材線蟲陽性及線蟲數(shù)量檢測

采用松材線蟲恒溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條檢測試劑盒，對樣地中注干后所有死亡松樹采用貝爾曼漏斗法進(jìn)行線蟲分離，并進(jìn)行線蟲陽性檢測。結(jié)果表明：所有死亡松樹內(nèi)均含有松材線蟲，含線蟲數(shù)量至少為897.34條·g－1。

表3　注干后枯死松樹松材線蟲陽性及線蟲數(shù)量檢測Table 3　Positive and quantitative detection of Bursaphelenchus xylophilus in died pine tree

3　結(jié)論與討論

研究了6種藥劑注干施藥防控松材線蟲的林中效果，并初步測定了藥劑主要成分注藥3個(gè)月和1 a后在樹體內(nèi)殘留動(dòng)態(tài)及添加回收率。各藥劑有效成分注干后在松樹體內(nèi)均能被檢測到，其中5.0%啶蟲脒注干劑與3.0%甲維鹽注干防治劑在藥后3個(gè)月檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為（5.67±1.07）和（2.65±0.35）mg·kg－1，均高于藥劑對松材線蟲的95%致死濃度值（LC95）0.75 mg·kg－1，而在藥后1 a，3.0%甲維鹽注干防治劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高為（0.95±0.11）mg·kg－1，依然高于LC95（0.75 mg·L-1）［13］，注藥2 a后，盡管馬尾松的死亡率由防治1 a后的0.2%～2.4%增加至防治2 a后的0.4%～4.4%，藥劑持效期有所下降，但其防治效果還是有所提高，所有藥劑在注干2 a后防治效果在80%以上（除0.3%苦參堿疫苗注射液外），說明各藥劑能在樹體內(nèi)有一定的持效期且能一定程度殺死線蟲。

藥劑在樹木體內(nèi)傳導(dǎo)與蒸騰作用有極其密切的關(guān)系。藥劑在樹體內(nèi)的長距離輸導(dǎo)發(fā)生在木質(zhì)部（向頂性）或韌皮層（向頂性和向基性）［15］，而在散孔材和針葉樹體內(nèi)的輸導(dǎo)則是在整個(gè)木質(zhì)部邊材中進(jìn)行［16］。接種試驗(yàn)和組織病理學(xué)研究表明：樹脂道泌脂細(xì)胞最先受到線蟲侵襲，造成軸向和射線薄壁細(xì)胞死亡［17］。受害樹木木質(zhì)部中的射線薄壁細(xì)胞的死亡可以使管胞空穴化，因而造成木質(zhì)部輸水堵塞，致使藥劑在樹體內(nèi)傳導(dǎo)緩慢甚至不能傳導(dǎo)［18－19］。同時(shí)，樹木的種類、樹齡及天氣條件如溫度、濕度、風(fēng)速等都會影響樹木對水分及藥劑的吸收和傳導(dǎo)，殺蟲劑的理化性質(zhì)對傳導(dǎo)速度和傳導(dǎo)量的影響更為明顯，因此，即使藥劑注干，仍可能傳導(dǎo)不充分或不傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致部分樹木受松材線蟲病危害而緩慢死亡［20］。對藥后死亡松樹體內(nèi)沒有檢測到藥劑殘留量，說明藥劑并未隨樹木蒸騰作用在體內(nèi)傳導(dǎo)，沒有對松材線蟲起到預(yù)防作用。對死亡松樹中進(jìn)行松材線蟲檢測均呈陽性且線蟲數(shù)量均大于897.34條·g－1也證明了殘留檢測結(jié)果。

本試驗(yàn)中，砍伐松林中死樹是一種傳統(tǒng)的防治手段，但不能清除林中且有隱蔽性 “松材線蟲病潛在攜帶者”的松樹［2］。據(jù)FUTAI［21］報(bào)道：松樹感染松材線蟲后，受到外界環(huán)境如氣候變冷、溫度過高等影響，松材線蟲在松樹體內(nèi)繁殖受到嚴(yán)重影響，進(jìn)入 “潛伏期”，致使松樹不能立刻表現(xiàn)出癥狀或發(fā)病死亡，但這些松樹緩慢的變化，難逃松材線蟲的傳播媒介松墨天牛Monochamus alternatus的 “法眼”，依然可以傳播松材線蟲。野外觀察結(jié)果證實(shí)，在線蟲侵染的初期，進(jìn)入樹木的線蟲大多分布在侵染點(diǎn)周圍，線蟲群體的增長則是在病樹分泌樹脂停止和出現(xiàn)外部癥狀后開始，樹脂道、射線和形成層內(nèi)出現(xiàn)空洞，并緩慢延伸至皮層和木質(zhì)部，引起組織的破壞，導(dǎo)致松樹在1～2 a內(nèi)死亡［22］。實(shí)驗(yàn)中清理死樹對照區(qū)2 a后，松樹死亡率還是有明顯的增加（表1），與上述研究結(jié)果相符。

注干施藥防治松材線蟲，是一種 “打點(diǎn)控面”的防治技術(shù)，注入樹體內(nèi)的藥劑在一定程度上可以滅殺松材線蟲［6，12，23］，也可影響松墨天牛的生長發(fā)育，控制松墨天牛種群密度，抑制其傳播松材線蟲［24］。上述6種藥劑注藥2 a后的松樹死亡率較不清理死樹對照區(qū)域明顯降低。從防治后的數(shù)據(jù)得知，高濃度的甲維鹽、阿維菌素系列藥劑防效均在80%以上，對新疫點(diǎn)的拔除，老疫點(diǎn)控制均具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，推薦在重點(diǎn)防治區(qū)預(yù)防應(yīng)用。

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Field efficacy of six trunk-injected pesticides on Bursaphelenchus xylophilus

LI Qiao1，ZHANG Shaoyong2，QIU Huikang2，CHEN Ming3，YE Yuzhu1，YUAN Yuan1
（1.Forest Enterprise of Jingning County，Jingning 323500，Zhejiang，China；2.Local and National Joint Engineering Laboratory of Biopesticide High-efficient Preparation Technology，Zhejiang A&F University，Lin'an 311300，Zhejiang，China；3.Forest Pest Control Quarantine Station of Jinyun County，Jinyun 321400，Zhejiang，China）

Forest efficacy of six liquid-formulated trunk-injected pesticides（avermectin，emamectin benzoate，matrine and acetamiprid）were studied using auto flow trunk injection.After 15 months residues from liquidformulated trunk-injections in pine were recovered and detected using high-performance liquid chromatography （HPLC）.Also，positive and quantitative detection of Bursaphelenchus xylophilus（BX）in dead pine trees was studied with a BX Isothermal Amplification Diagnostic Kit.Results showed that the prevention effect from the six liquid-formulated trunk injection pesticides was significant（P＜0.05）with one injection controlling pine death rate between 0.4%－4.4%for two consecutive years.Avermectin，emamectin benzoate，and aloperine with trunk-injection slowed the spread of pine wilt disease with a field efficacy above 80%.All liquid-formulated residue concentrations in the trunk xylem were reached except dead pine trees one year after injection the maximum residue concentration was found with emamectin benzoate［having at least（0.15±0.11）mg·kg－1］. Also，after injection all pine trees died due to BX nematodes with an average BX nematode content of at least 897.34 g－1in the trunk xylem.Thus，because of its favorable effect and long duration of efficacy，this liquidformulated pesticide injection could be popularized and used in practical control.［Ch，3 tab.24 ref.］

forest protection；Bursaphelenchus xylophilus；chemical control；trunk-injection agent；residue de-tection；field efficacy

S763.3

A

2095-0756（2016）04-0718-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.023

2015-06-22；

2015-11-09

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201204501）；浙江省景寧縣科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A05-2）

李橋，工程師，從事農(nóng)林病蟲害測報(bào)、防治和害蟲生物學(xué)研究。E-mail：liqiaoxinong@126.com。通信作者：張紹勇，博士，從事生物農(nóng)藥研究。E-mail：1zhangshaoyong@163.com