余福恒,胡　芳,汪宏良,李仲娟*,李　超,柯蕭韻,陳　敏

(1黃石市東方衛(wèi)生社區(qū)服務(wù)中心，湖北 黃石 435000;2湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003)

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靈芝酸G誘導(dǎo)Vβ3+CD8+T細(xì)胞抗腫瘤活性的研究

余福恒1,胡芳2,汪宏良2,李仲娟2*,李超2,柯蕭韻2,陳敏2

(1黃石市東方衛(wèi)生社區(qū)服務(wù)中心，湖北 黃石 435000;2湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003)

為探討SEA(Staphylococcus Enterotoxin A，SEA)存在下的靈芝酸G(Licochalcone-G，LG)對(duì)小鼠CD8+細(xì)胞活化及殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，采用流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)CD8+細(xì)胞表面分子表達(dá)及活化后細(xì)胞內(nèi)的顆粒酶B(Granzyme B，GrB)和穿孔素(Perforin，Pf)的水平、Caspase-3酶的活性分析腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)果為:SEA組和SEA+LG組經(jīng)過(guò)3 d刺激能激活小鼠CD8+細(xì)胞Vβ3和Vβ11分別為7.4±0.45，11.5±0.72。體外實(shí)驗(yàn)顯示， SEA組和SEA+LG組的Vβ3+CD8+T細(xì)胞內(nèi)GrB % 的水平分別為70.2±8.04，91.6±8.16;Pf % 的水平分別為67.3±6.86，86.4±7.17，與對(duì)照組相比有顯著性差異(t=5.24，t=6.43；t=4.31，t=5.47，P<0.01)；SEA組和SEA+LG組的HL-60腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3酶的活性分別為37.6±4.81，68.8±6.82，與對(duì)照組相比有顯著性差異(t=3.18，t=5.27，P<0.01)；SEA組和SEA+LG組的A20腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3酶的活性分別為23.7±3.58，54.1±5.71，與對(duì)照組相比有顯著性差異(t=4.23，t=4.88，P<0.01)。SEA依賴(lài)的LG能促使小鼠CD8+T細(xì)胞Vβ3和Vβ11分子活化，活化的Vβ3+CD8+T細(xì)胞內(nèi)分泌大量的GrB和Pf，并通過(guò)Caspase-3的信號(hào)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

顆粒酶B；靈芝酸G；腫瘤細(xì)胞

靈芝酸大多來(lái)源靈芝，是一種三萜類(lèi)化合物[1]。由于分離方法學(xué)的限定，靈芝酸的單體成分生產(chǎn)量極少[2-3]，只有極少部分的靈芝酸單體成分的藥理作用被廣泛研究[4-5]。本次研究樣品LG是高效液相色譜法分離出的15種三萜類(lèi)活性成分之一，希望通過(guò)有限的LG樣本，來(lái)探討SEA依賴(lài)的LG對(duì)小鼠CD8+T細(xì)胞活化的分子基礎(chǔ)及殺細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)理。

1　材料

1.1試藥

濃度為20 mg/mL LG由日本靈芝研究所友情提供;SEA、A20細(xì)胞和HL-60細(xì)胞由日本東京女子醫(yī)科大學(xué)免疫室友情提供;FITC-Caspase3、PKH-26熒光染料、PE-CD8抗體、磁珠抗體和CD8磁珠抗體購(gòu)自BD公司;酶標(biāo)板、PRMI-1 640培養(yǎng)粉購(gòu)自GIBCO公司;Hanks液、胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司;PE-Granzyme B 和FITC-Perforin抗體購(gòu)自eBiosource公司。

1.2動(dòng)物

清潔級(jí) C57BL/6純系小鼠，雄性，8周齡，體重18～22 g(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0004)。小鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、SEA組和SEA+LG混合組,每組 10只。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后，連續(xù)腹腔注射蒸餾水、SEA或SEA+LG混合液3 d，收集小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2　方法

2.1免疫磁珠法分選小鼠CD8+細(xì)胞

取 C57BL/6 小鼠脾臟，玻璃片磨碎200目紗網(wǎng)過(guò)濾后溶血，10% FCS PRMI-1 640培養(yǎng)基15 mL離心洗滌3次，0.04%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞；按磁珠抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將107/mL細(xì)胞液用10%的PRMI-1 640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，加入適量的生物素標(biāo)記的雞尾酒抗體(Biotin- Antibody Cocktail包括抗CD4，CD14，CD19，CD123,CD16和TCRγ/δ)混勻，4 ℃孵育 15 min，10%的PRMI-1 640細(xì)胞培養(yǎng)液 1 500 r/min離心5 min、洗滌3次后，最終總細(xì)胞懸液1 mL置于 Midi MACS分選器中分選[6]，收集CD8+細(xì)胞備用。

2.2CD8+T細(xì)胞表面亞分子的檢測(cè)

用4 ℃預(yù)冷的 PBS 收集12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的CD8+T細(xì)胞，并用冰冷2% 的流式細(xì)胞緩沖液(FACS 液)洗滌2 次，加入純化的鼠IgG 封閉細(xì)胞表面 Fc受體，PE標(biāo)記的抗小鼠CD8單抗和 FITC 標(biāo)記的抗小鼠Vβ(3.6.11.12)系列單抗同時(shí)冰浴30 min 染色， FACS 液洗滌3次，經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本測(cè)定，設(shè)沒(méi)有標(biāo)記的Vβ+CD8+細(xì)胞作對(duì)照。

2.3CD8+T細(xì)胞GrB和Pf的測(cè)定

GrB和Pf的測(cè)定按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，收集溶劑對(duì)照組、SEA組和SEA+LG組刺激3 d的Vβ3+CD8+T細(xì)胞用2%的流式細(xì)胞液洗滌3次，分別用PE-Granzyme B 和FITC-Perforin抗體進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀測(cè)定Vβ3+CD8+T細(xì)胞內(nèi)的GrB和Pf的表達(dá)量。

2.4腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3酶的活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期HL-60或A20細(xì)胞用10% PRMI-1 640洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為107個(gè)/mL。用紅色熒光PKH-26冰浴染色30 min，洗滌3次后分別與Vβ3+CD8+T細(xì)胞一起 37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)3 h， 收集細(xì)胞并用FITC 標(biāo)記的抗小鼠 Caspase-3抗體染色30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定HL-60或A20細(xì)胞Caspase-3酶的活性。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3　結(jié)果

3.1SEA依賴(lài)的LG對(duì)小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞表面Vβ+分子的影響

SEA能與機(jī)體內(nèi)CD8+T 細(xì)胞MHC分子架橋活化，通過(guò)SEA 或SEA+LG一起誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞β鏈不同結(jié)合區(qū)域的活性表達(dá)[7]。10 μg /mL靈芝酸G、1 μg/mL SEA和他們的混合物溶液連續(xù)腹腔注射3 d，收集小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞，免疫熒光染色后流式細(xì)胞儀測(cè)定Vβ3、Vβ6、Vβ8、Vβ11和Vβ12的陽(yáng)性分子表達(dá)。不同刺激物對(duì)小鼠體內(nèi)Vβ細(xì)胞數(shù)量的影響見(jiàn)表1。表1顯示，不同刺激物對(duì)小鼠體內(nèi)Vβ6和Vβ8細(xì)胞數(shù)量的升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在后面的實(shí)驗(yàn)體系中，為了更加準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同藥物對(duì)相同群組小鼠的免疫細(xì)胞中不同亞分子的作用，Vβ6會(huì)作為實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照做進(jìn)一步研究。SEA和LG混合物與對(duì)照組相比，可以顯著性升高Vβ3和Vβ11的分子表達(dá)(P<0.01)；與SEA組對(duì)比，SEA+LG組中Vβ3、Vβ11和Vβ12細(xì)胞數(shù)量有顯著性差異(P<0.01)。

表1　不同刺激物對(duì)小鼠體內(nèi)Vβ細(xì)胞數(shù)量的影響±s,n=10)

注:與對(duì)照組相比較，*P<0.01；SEA+LG與SEA組相比較，◆P<0.01。

3.2SEA依賴(lài)的LG對(duì)小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞分泌GrB和Pf的影響

不同刺激物對(duì)VβCD8+T細(xì)胞內(nèi) GrB和Pf的影響結(jié)果見(jiàn)表2。GrB和Pf的分泌是效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫的主要途徑[8]，通過(guò)分析SEA 或SEA+LG一起體外誘導(dǎo)活化的陰性對(duì)照Vβ6、陽(yáng)性活化細(xì)胞Vβ3的CD8+T細(xì)胞內(nèi)GrB和Pf水平的變化發(fā)現(xiàn)(表2)，Vβ6+細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)GrB和Pf水平并沒(méi)有升高；SEA組或SEA+LG組體外誘導(dǎo)Vβ3+CD8+T細(xì)胞內(nèi)GrB和Pf的水平與對(duì)照組Vβ6+細(xì)胞相比有顯著性差異(t=5.24，t=4.31，*P<0.01)；Vβ3+細(xì)胞的SEA組與SEA+LG組對(duì)比，GrB和Pf的水平均有顯著性差異(t=6.43，t=5.47，**P<0.01)。

表2　不同刺激物對(duì)VβCD8+T細(xì)胞內(nèi) GrB和Pf的影響

注:與陰性對(duì)照組相比較，*P<0.01；SEA+LG與SEA組相比較，**P<0.01。

3.3 Vβ3+CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的影響

CD8+T細(xì)胞內(nèi)GrB和Pf是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要方式，CD8+T細(xì)胞內(nèi)GrB和Pf的含量增多，與腫瘤內(nèi)死亡酶Caspase-3的活性具有高度相關(guān)性[9]。不同刺激物對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的影響結(jié)果見(jiàn)表3。表3顯示，SEA組與SEA+LG組的Vβ3+CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)3 h，腫瘤細(xì)胞HL-60和A20 Caspase-3酶活性與對(duì)照組相比有顯著性差異(t=3.18，t=4.23，*P<0.01)。SEA組與SEA+LG組對(duì)比分析，腫瘤細(xì)胞HL-60 和A20 Caspase-3酶活性有顯著性差異(t=5.27，t=4.88，**P<0.01)。

表3　不同刺激物對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的影響( ±s,n=10)

注:與陰性對(duì)照組相比較，*P<0.01；SEA+LG與SEA組相比較，**P<0.01。

4　討論

SEA不僅能與TCR的β鏈架橋促使T細(xì)胞的增殖活化，還可以使活化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要體現(xiàn)[10]。本次研究是通過(guò)SEA依賴(lài)的LG對(duì)T細(xì)胞刺激和誘導(dǎo)，篩選出了SEA依賴(lài)的LG對(duì)T細(xì)胞活化的亞分子Vβ3、Vβ11和Vβ12，而對(duì)Vβ6和Vβ8沒(méi)有活化作用，明確了SEA依賴(lài)的LG免疫活化的分子基礎(chǔ)。

近年來(lái)，靈芝酸A-C和Mf的體內(nèi)抗腫瘤活性一直被研究和關(guān)注[11]。我們的團(tuán)隊(duì)也證實(shí)了靈芝酸G的抗腫瘤活性與免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)[12]。本次研究在活化分子Vβ3的基礎(chǔ)上，與陰性對(duì)照分子Vβ6在細(xì)胞毒性上做了進(jìn)一步對(duì)照研究，通過(guò)SEA依賴(lài)的LG對(duì)Vβ3和Vβ6 T細(xì)胞的刺激和誘導(dǎo)，體外考察這2類(lèi)細(xì)胞的顆粒酶和穿孔素的活性，與單純SEA誘導(dǎo)相比有顯著性差異(P<0.01)，這說(shuō)明SEA依賴(lài)的LG在抗腫瘤方面的作用是顆粒酶和穿孔素的途徑。本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)Vβ3和Vβ6在體外與HL-60和A20腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)3 h后，考察了腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3酶的活性。發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照細(xì)胞Vβ6對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用，Vβ3對(duì)2種腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，與單純SEA誘導(dǎo)相比有顯著性差異(P<0.01)。

本次研究結(jié)果揭示SEA依賴(lài)的LG能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞亞分子的活化，促使Vβ3 T細(xì)胞產(chǎn)生大量的GrB和Pf，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為L(zhǎng)G成為抗腫瘤藥物提供了科學(xué)的依據(jù)。

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(責(zé)任編輯吳鴻霞)

Study on Antitumor Activity of Vβ3+CD8+T Cells Induced by Ganoderma Lucidum G

YuFuhen1,HuFang2,WangHongliang2,LiZhongjuan2*,LiChao2,KeXiaoyun2,ChenMin2

(1Huangshi Dong Fang Community Health Service Center,Huangshi Hubei 435000;2School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective： To explore the effect of Staphylococcus Enterotoxin A(SEA) dependent ganoderic acid Licochalcone-G (LG) on CD8+cell activation and killing tumor cells in mouse.Method：The levels of intracellular Granzyme B(GrB) and Perforin (Pf),after surface molecules on CD8+cells were expressed and activated,detected by flow cytometry.Apoptosis of tumor cells was analyzed by the detection of Caspase-3 Enzyme activity.Result：After SEA group and SEA+LG group had been stimulated for 3 days,Vβ3 and Vβ11 of CD8+cells in mouse could be activated,and were 7.4±0.45 and 11.5±0.72 respectively.There were significant difference compared with the control group(t=5.24，t=6.43；t=4.31，t=5.47，P<0.01).GrB activity in HL-60 tumor cells of SEA group and SEA+LG group of were 70.2±8.04 and 91.6±8.16 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=5.24，t=6.43，P<0.01) Pf activity in A20 tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 67.3±6.86 and 86.4±7.17respectively,and had significant difference compared with the control group(t=4.31，t=5.47，P<0.01).HL-60 Caspase-3 Enzyme activity in tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 37.6±4.81 and 68.8±6.82 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=3.18，t=5.27，P<0.01).Caspase-3 Enzyme activity in A20 tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 23.7±3.58 and 54.1±5.71 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=4.23，t=4.88，P<0.01).Conclusion：SEA dependent on LG can prompt Vβ3 and Vβ11 of CD8+cells in mouse to be activated.Large amount of GrB and Pf were excreted in activated Vβ3+CD8+T cells and induced tumor cell apoptosis through Caspase-3 signaling pathway.

Granzyme B；LG；tumor cell

2016-04-23

湖北省科技項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2011Cdc116);黃石市科技項(xiàng)目(黃科農(nóng)〔2012〕1號(hào));教育部46批留學(xué)歸國(guó)啟動(dòng)資金支持(46-1)。

余福恒,主管技師，本科。

李仲娟，副教授，博士, 研究方向：細(xì)胞分子學(xué)。

10.3969/j.issn.2095-4565.2016.04.013

R967

A

2095-4565(2016)04-0054-04