鄭德杉,王三亞,汪文強(qiáng),鄧　奇,喻　昕

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,湖北 黃石 435003)

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樣品處理方法對(duì)雷公藤葉中雷公藤甲素含量測定結(jié)果的影響

鄭德杉,王三亞,汪文強(qiáng),鄧奇,喻昕*

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,湖北 黃石 435003)

探討用高效液相色譜法測定雷公藤葉中雷公藤甲素含量時(shí)，樣品處理方法對(duì)含量測定結(jié)果的影響。分別用石油醚除雜—70%甲醇水提—氯仿萃取，乙酸乙酯提取—氧化鋁柱分離，石油醚除雜—乙酸乙酯提取—氧化鋁柱分離3種方法處理樣品，采用HPLC法測定雷公藤甲素含量。結(jié)果為：石油醚除雜—70%甲醇水提—氯仿萃取處理得到的雷公藤甲素峰分離效果最好，色譜峰保留時(shí)間為19.732 min，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致，含量高出后2種方法處理樣品所得到的雷公藤樣品溶液約4倍以上。在制訂雷公藤葉中雷公藤甲素含量測定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，建議采用石油醚除雜—70%甲醇水提—氯仿萃取方法進(jìn)行樣品處理。

雷公藤葉；樣品制備；HPLC法；色譜圖

雷公藤在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及腫瘤治療中發(fā)揮著重要的作用[1-2]，但由于人們長期忽視野生雷公藤種子資源的維護(hù)，導(dǎo)致野生雷公藤資源幾近枯竭。國內(nèi)唯一的雷公藤GAP種植基地福建泰寧的雷公藤根，由于種植周期需6年，生產(chǎn)成本高，單價(jià)已報(bào)至百元以上。雷公藤葉代替根應(yīng)用于臨床已成為趨勢，雷絡(luò)酯片的開發(fā)、雷公藤葉中提取雷公藤甲素單體的研究如火如荼。提取分離方法的選用嚴(yán)重影響到葉中雷公藤甲素含量測定結(jié)果的高低。張敏[3]采用與雷公藤根相似的甲醇提取、中性氧化鋁柱分離的方法測定了6～7月采集的種源于泰寧扦插的雷公藤葉9份樣品，其中4份樣品中沒有檢測到雷公藤甲素，4份樣品含量在0.5 μg/g以下，只有1份樣品含量為3.486 μg/g。吳春敏[4]采用甲醇—乙腈提取—OASISHLB3cc固相萃取小柱分離的方法測定6月采集的福建泰寧的2份樣品，1份沒有檢測到雷公藤甲素，1份含量為9.9 μg/g。本研究采用3種方法提取分離葉中雷公藤甲素，HPLC法測定含量，旨在尋找到比較好的樣品處理方法，以便更準(zhǔn)確地測定葉中雷公藤甲素的含量。

1　材料與儀器

1.1藥材來源

雷公藤葉是野生于江西萍鄉(xiāng)、湖南岳陽、湖北通城、福建泰寧、浙江麗水5省，移栽至黃石1年，再采集枝條扦插成活2年的雷公藤的葉，消除了種植年限對(duì)雷公藤甲素含量的影響，分別于2015年7月、11月在湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院雷公藤種植基地采集，將葉平鋪于桌面晾干，粉碎備用。

1.2儀器與試劑

STI 501型HPLC色譜系統(tǒng)(賽智科技)，Kromastar C18柱(250 mm×4.6 mm；5 μm)；QT08超聲清洗器(天津市瑞普電子儀器公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；雷公藤甲素(批號(hào)：Y2556Y17052，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)，色譜用水為雙蒸水；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳等均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：218 nm；常溫柱；進(jìn)樣量20 μL[5]。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加甲醇定容至10 mL，得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取貯備液，用甲醇分別稀釋成2,5,10,20,50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。 進(jìn)樣檢測，以濃度C對(duì)峰面積A求出線性回歸方程為：A=74796C-141853，r=0.9992，線性范圍為2～50 μg/mL。

2.3樣品處理及制備

2.3.1方法1

取11月采湖北通城雷公藤葉5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加石油醚100 mL，微沸回流2 h，濾除石油醚，揮干藥渣。加70%甲醇溶液120 mL，回流2 h，分離得到甲醇提取液，重復(fù)提取1次，合并得到的甲醇提取溶液，減壓回收甲醇；剩余水液用四氯化碳層50 mL分2次萃取，棄四氯化碳；水液用氯仿75 mL分3次萃取，合并氯仿萃取液，減壓回收氯仿至干，甲醇9 mL分2次加入溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，得樣品溶液Ⅰ[6-7]。

2.3.2方法2

取11月采湖北通城雷公藤葉的粉末5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL乙酸乙酯，微沸回流提取2 h，過濾，收集濾液，殘?jiān)右宜嵋阴ブ靥?次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至小體積，過中性氧化鋁柱(10 g中性氧化鋁、柱內(nèi)徑1.0 cm)，用100 mL乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液，濃縮，甲醇溶解并定容至10 mL轉(zhuǎn)移至容量瓶，得樣品溶液Ⅱ[5]。

2.3.3方法3

取11月采湖北通城雷公藤葉的粉末5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL石油醚，微沸回流2 h，濾除石油醚，揮干藥渣。加100 mL乙酸乙酯，按“2.3.2”項(xiàng)下方法提取分離，得樣品溶液Ⅲ。

2.4樣品中雷公藤甲素含量測定

分別將不同方法處理所得到的樣品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ過0.45 μm微孔濾膜，取20 μL進(jìn)樣，測得峰面積A，代入回歸方程計(jì)算含量，3種樣品處理方法所測雷公藤甲素含量見表1，不同方法制備的樣品溶液色譜圖見圖1。

表1　3種樣品處理方法所測雷公藤甲素含量(n=3)

圖1　HPLC色圖譜

2.55省雷公藤葉中雷公藤甲素含量測定

分別取種源于江西萍鄉(xiāng)、湖南岳陽、湖北通城、福建泰寧、浙江麗水5省，于黃石野生馴化扦插的雷公藤葉各2 g(7月采集)，精密稱定，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取20 μL進(jìn)樣，測得峰面積A，代入回歸方程計(jì)算含量，5省雷公藤葉中雷公藤甲素含量見表2。

表2　5省雷公藤葉中雷公藤甲素含量(n=3)

2.6加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的11月采湖北通城雷公藤葉粉末2.0 g，共6份，分別精密加入雷公藤甲素對(duì)照品溶液(0.50 mg/mL)0.08，0.1，0.12 mL各2份，按方法1樣品溶液制備方法制備，依法測定。6次平均回收率為95.4%，RSD為2.55%，加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

3.13種樣品處理方法的設(shè)定

李漢保[6]利用溶劑萃取分離的方法得到“雷公藤葉中雷公藤甲素含量高于根3倍”的結(jié)論；程敬麗[7]等用溶劑萃取分離方法得到雷公藤甲素濃度高達(dá)1.83%的氯仿溶液，并且對(duì)石油醚、四氯化碳萃取液進(jìn)行了檢測，基本沒有檢測到雷公藤二萜內(nèi)酯類化合物。故本試驗(yàn)選擇了石油醚除色素—甲醇水提—氯仿萃取作為方法1；方法2中乙酸乙酯提取—氧化鋁柱分離與湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雷公藤根的含量測定方法相似；由于葉中含大量的色素，故方法3在雷公藤根的檢測方法基礎(chǔ)上增加石油醚除色素步驟。

3.23種樣品處理方法的結(jié)果比較

從樣品溶液的顏色看，方法1得到淡黃色溶液，方法2得到綠色溶液，方法3得到淡綠色溶液，說明色譜柱并不能很好地除去色素類雜質(zhì)。從色譜圖上看，方法1中雷公藤甲素的保留時(shí)間基本與標(biāo)準(zhǔn)品一致(19.732 min)，且峰形對(duì)稱，分離效果較好；方法2和方法3中雷公藤甲素峰不明顯，只在20.731 min附近有一峰形寬、對(duì)稱性不佳的峰。表1中數(shù)據(jù)顯示，方法1所測雷公藤甲素含量高出方法2、方法3約4倍以上。方法1的石油醚提取、四氯化碳萃取都可以不同程度地去除色素、脂溶性雜質(zhì)，氯仿萃取可以富集雷公藤甲素。方法2、方法3用中性氧化鋁柱除雜質(zhì)，分離雷公藤甲素，如果雷公藤葉取樣量少，則雷公藤甲素容易因洗脫不完全而損失，使得測定結(jié)果出現(xiàn)負(fù)誤差。

3.3與文獻(xiàn)結(jié)果比較

表2中數(shù)據(jù)顯示，同是7月份采集的福建泰寧、江西萍鄉(xiāng)、浙江麗水野生馴化扦插的雷公藤葉，用方法1處理樣品時(shí)，測得雷公藤甲素含量高出以往的文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，只有湖北通城、湖南岳陽2個(gè)種源的雷公藤葉沒有檢測到雷公藤甲素。故筆者認(rèn)為用石油醚除色素—甲醇水提取—氯仿萃取的方法處理樣品，可以更準(zhǔn)確地測定雷公藤葉中雷公藤甲素的含量。表2中數(shù)據(jù)同時(shí)也說明雷公藤能適應(yīng)長江流域的氣候，在鄂東南也能正常生長，但不同種源雷公藤葉中雷公藤甲素含量存在明顯差異，符合文獻(xiàn)報(bào)道[8]。

[1]王均琴，李國春，周學(xué)平，等.雷公藤提取物治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的Meta分析[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014,23(10):1032-1035.

[2]徐佳，伍春蓮.雷公藤紅素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J].中藥材，2015,38(9)：1925-1928.

[3] 張敏.不同產(chǎn)地雷公藤根、葉的主要活性成分研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[4]吳春敏.雷公藤化學(xué)成分與多組分含量測定研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2010.

[5]湖北省食品藥品監(jiān)督管理局.湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2009：148-149.

[6]李漢保，王玉璽，王曙東，等.雷公藤地上部分資源利用初探[J].中藥材，1990(4)：16-17.

[7]程敬麗，朱烈，朱國念，等.雷公藤甲素的提取工藝[J].農(nóng)藥，2005，44(7)：316-318.

[8]斯金平，阮秀春，郭寶林.雷公藤和昆明山海棠形態(tài)變異的研究[J].浙江林業(yè)科技，2005,25(1)：2-4.

(責(zé)任編輯吳鴻霞)

Effects of Sample Preparation Methods on Determination Results of Triptolide in Tripterygium Wilfordii Leaf

Zheng Deshan,Wang Sanya,Wang Wenqiang,Den Qi,Yu Xin*

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective:to explore the effects of sample preparation methods on the determination results of triptolide in Tripterygium Wilfordii leaves by the high performance liquid chromatography (HPLC).Methods:Petroleum ether impurity,70% methanol water provided-chloroform extraction;ethyl acetate extraction-alumina column separation;and petroleum ether impurity,ethyl acetate extract-alumina column,the three methods were used to prepare for the test solution,HPLC was used to detect the content of triptolide. Results:With the method of petroleum ether impurity,70% methanol water provided-chloroform extraction preparation for the test solution, the peak retention time was 19.732 min,retention time was basical the same with standard,content is four times higher than the two other preparation methods for the solution.Conclusion:The method of petroleum ether impurity,70% methanol water provided-chloroform extraction is suggested to be used in the quality standard of Tripterygium Wilfordii leaves.

Tripterygium wilfordii leaves;sample preparation;HPLC;chromatogram

2016-03-16

湖北高校省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201410920012；201510920008)。

鄭德杉，本科生。

喻昕，教授，博士，研究方向：藥物分析及生物制藥技術(shù)。

10.3969/j.issn.2095-4565.2016.04.014

R284.2

A

2095-4565(2016)04-0058-04