王　希，王宗成

(1 株洲市食品藥品檢驗所，湖南　株洲　412000；2 湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南　永州　425199)

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超聲波輔助堿水提取杠板歸中黃酮的工藝研究*

王希1，王宗成2

(1 株洲市食品藥品檢驗所，湖南株洲412000；2 湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南永州425199)

采用超聲波堿水提取杠板歸中的總黃酮，并采用分光光度法，以蘆丁為標準品測定杠板歸中總黃酮的提取率。通過單因素實驗分析了pH值，提取時間，料液比三個主要因素對黃酮提取的影響，并通過正交實驗設計優(yōu)化了杠板歸中總黃酮提取條件。實驗結果表明，杠板歸中總黃酮超臨界提取的最佳條件為pH值為9，時間為40 min, 料液比為1:50，該條件下杠板歸中總黃酮的提取率為14.72 mg/g。

杠板歸；總黃酮；超聲波輔助提取

杠板歸為蓼科植物杠板歸的干燥地上部分，具有清熱解毒、利水消腫、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎、止咳祛痰、護肝、抗癌等作用[1]。臨床上可用于腎炎水腫、百日咳、瀉痢、濕疹、癤腫、毒蛇咬傷等[2]。黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、降血糖、治療骨質疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等功效[3]，因此，黃酮類化合物的功用引起了人們的廣泛重視[4]。近幾年來，從植物中提取分離黃酮化合物開發(fā)保健食品、化妝品的研究非常多[5-7]。杠板歸主要含有黃酮類、蒽醌類、苯丙素糖酯類和其他類化合物[8]。從杠板歸中得到的黃酮類化合物有山萘酚、槲皮素、蓄苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、槲皮素-3-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯、山萘酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁等[9]。黃酮類物質由于含有酚羥基呈弱酸性一般易溶于堿性溶液，所以在提取的時候可用堿性溶液提取能得到較高的提取率[10]。而超聲輔助提取與常規(guī)浸泡提取法過程相比，超聲空化作用加快了提取速度，縮短了提取時間，進而提高了天然產(chǎn)物中活性成分的提取率[11]。本試驗基于當前研究狀況和開發(fā)利用湖南當?shù)刂参镔Y源，采用有利于工業(yè)化生產(chǎn)的超聲提取方法提取杠板歸中的黃酮，采用正交試驗設計對杠板歸黃酮提取工藝進行優(yōu)化獲得較佳工藝。以期將杠板歸中的黃酮類化合物開發(fā)成抗氧化保健食品，為進一步開發(fā)利用杠板歸提供理論依據(jù)。

1　實　驗

1.1實驗材料與試劑

實驗材料為杠板歸莖葉；蘆丁(標準品)，中國藥品生物制品檢定所；95%乙醇、亞硝酸鈉、氧化鈣、硝酸鋁，NaOH等試劑均為分析純。

1.2主要儀器

超聲波萃取器；旋轉蒸發(fā)儀；離心沉淀器；電子天平；循環(huán)水式真空泵；UV-1750型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

2　結果與討論

2.1標準溶液的配制

稱取約50 mg蘆丁標準品于稱量瓶中置105 ℃烘箱下烘干至恒重，干燥器中冷卻，精確稱取25 mg蘆丁標準品，用70%乙醇定容100 mL為標準液。

2.2黃酮含量測定標準曲線的繪制

精確量取1、2、3、4、5、6 mL蘆丁標準液，分別置于25 mL容量瓶中，各加6 mL 70%乙醇溶液，再分別加5%亞硝酸鈉溶液1 mL混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL混勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以試劑空白作參比，用1 cm比色皿在510 nm波長處測定吸光度，計算標準液濃度(C)與吸光度(A)的回歸方程A=bC+k，得到回歸方程為：D=9.7829C+0.0199(R2=0.9987)。

2.3樣品處理方法

將杠板歸除去雜質、洗凈、切碎，再在105 ℃烘至恒重。取出樣品用濾紙包住，放入干燥器中冷卻備用。

2.4黃酮的提取

堿性提取液選擇價廉易得的石灰水。準確稱取1.0 g剪碎的杠板歸于250 mL燒杯中，按一定的料液比加入一定pH值的堿性Ca(OH)2溶液提取劑，浸泡2 h，超聲波提取一定時間后過濾，殘渣用少量提取劑洗滌3次，合并濾液, 定容于100 mL后，離心沉淀20 min，取上層清液10 mL，按照2.2分光光度法測定吸光度，計算總黃酮提取率。

2.5含量計算方法

按照標準曲線繪制方法操作，測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出測定樣品溶液總黃酮濃度C。然后計算樣品中總黃酮的提取率。

式中：C——測定樣品溶液總黃酮濃度，mg/mL

N——稀釋倍數(shù)

V——最初樣品定容體積，mL

m——樣品質量，g

2.6單因素實驗

2.6.1pH值對杠板歸黃酮提取率的影響

表1　pH值不同對總黃酮收率的影響

常溫下，料液比1:40，不同pH值條件下(8，9，10，11，12)，超聲波處理30 min，研究不同的pH值對杠板歸總黃酮得率的影響，結果如表1所示，隨著pH的增大，提取液的吸光光度值先增加，然后逐步降低，pH值為9時吸光光度值最大，相對應的提取率最高，考慮生產(chǎn)成本以及環(huán)保，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)時，pH值不能高于9。

2.6.2超聲提取時間對黃酮提取率的影響

常溫下，pH為9的堿水液，料液比1:40，攪拌條件下超聲輔助提取不同時間長度(20，30，40，50，60，70 min)，研究不同的提取時間對杠板歸總黃酮得率的影響，結果如表2所示，隨著超聲時間的增加，吸光光度值增加緩慢，超聲時間超過50 mim后吸光光度值迅速減少，即總黃酮收率降低。通過分析，發(fā)現(xiàn)30～50 min時提取率較高，為了節(jié)省時間，從工業(yè)成本和提取周期角度來看，超聲時間不宜超過50 min。

表2　超聲時間對總黃酮提取率

2.6.3料液比的選擇

常溫下，pH為9的堿水液，超聲波處理時間為60 min，研究不同的料液比(1:20，1:30，1:40，1:50)對杠板歸總黃酮得率的影響，結果如表3所示，開始時隨著料液比的減少，提取液的吸光光度值逐步增加，當料液比為1:40時，吸光光度值提達到最大，此時相對應的提取率最高，繼續(xù)減少料液比，吸光光度值反而有所減少，對總黃酮的提取不利。

表3　料液比對總黃酮收率的影響

2.7正交實驗

在單因素的基礎上，以pH值，超聲提取時間，料液比為考察因素，利用正交試驗設計方法設計三因素三水平的實驗，共進行九次實驗，從而確定超聲輔助堿水提取杠板歸中黃酮的最佳工藝條件[12]，正交試驗因素與水平見表4。

表4　正交試驗設計

正交試驗結果見表5，因素A的極差最大，其次是因素B，因素C的極差最小。極差分析可知，三個因素的影響順序為 A>B>C, pH對提取率影響最大，其次是超聲輔助提取時間，料液比的影響最小。對于A因素有K2>K3>K1，對于B因素有K2>K1>K3，對于C因素有K3>K2>K1，由此可確定最佳條件為A2B2C3，即pH為9，超聲提取時間40 min，料液比為1:50。

表5　正交實驗結果

2.8驗證實驗

根據(jù)篩選得到的最佳提取條件：pH為9，超聲提取時間40 min，料液比為1:50，平行提取3次，結果如表6所示。黃酮的提取率相比較最高，精密性較好，說明所得出的最佳工藝條件合理且具有較好的穩(wěn)定性。

表6　驗證性實驗

3　結　論

本文通過單因素和正交實驗，研究了pH，時間，料液比三個主要因素對黃酮提取的影響，結果表明：在影響杠板歸中總黃酮提取率的三個提取條件中，pH影響最大，為最顯著因子，其次為提取時間，料液比影響最??；杠板歸中總黃酮的最佳工藝為：選用pH值為9的Ca(OH)2溶液，時間為40 min, 料液比為1:50，此時杠板歸中總黃酮的提取率為14.72 mg/g。該工藝合理、簡單、方便，也有利于工業(yè)化提取生產(chǎn)。

參考資料

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Study on Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Total Flavonoids from Leaves of Perfoliote Knotweed Herb*

WANG Xi1, WANG Zong-cheng2

(1 Zhuzhou Institute for Food and Drug Control, Hunan Zhuzhou 412000;2CollegeofChemicalandBiologicalEngineering,HunanUniversityofScienceandEngineering,HunanYongzhou425199,China)

Total flavonoids in leaves of Perfoliote Knotweed Herb were extracted by ultrasonic-assisted and its extraction yield was detected by spectrometric method with rutin as standard material. In the extracting process of total flavonoids, three factors, including pH, solid-liquid ratio and extraction time, were studied by single factor analysis method. Based on single factor test, the optimal extraction conditions of total flavonoids were determined by orthogonal test as follows: pH was 9，solid-liquid ratio was 1:50, in 40 min, the extraction yield of total flavonoids from leaves of Perfoliote Knotweed Herb was 14.72 mg/g by the optimal process.

Perfoliote Knotweed Herb; total flavonoids; ultrasonic-assisted extraction

湖南省教育廳資助科研項目(15C0587)。

王希(1990-)，男，碩士，主要從事藥物合成及天然產(chǎn)物開發(fā)。

王宗成(1983-)，男，碩士，講師。

R284.2

A

1001-9677(2016)016-0057-03