趙小會(huì)，程翠利，周春姣, 蔣紅梅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南　長(zhǎng)沙　410128)

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10%精喹禾靈乳油對(duì)斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)

趙小會(huì)，程翠利，周春姣, 蔣紅梅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中糧食產(chǎn)量的提高離不開農(nóng)用除草劑的施用，而施用除草劑的過程中難免會(huì)造成環(huán)境的污染，進(jìn)而使環(huán)境生物受到迫害。以斑馬魚作為試驗(yàn)用魚，采用半靜態(tài)法測(cè)定10%精喹禾靈乳油對(duì)魚類的急性毒性。將斑馬魚置于配制好的精喹禾靈藥液中進(jìn)行染毒，利用高效液相色譜法測(cè)定斑馬魚經(jīng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h染毒后水體實(shí)際濃度，記錄相應(yīng)濃度下斑馬魚的死亡數(shù)目，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的致死中濃度，并觀察斑馬魚中毒癥狀。根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，確定10%精喹禾靈乳油農(nóng)藥的毒級(jí)為高毒。

精喹禾靈；斑馬魚；急性毒性；致死中濃度；高效液相色譜

農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的毒害大多是用藥不恰當(dāng)，超出了環(huán)境的自我凈化能力造成的，進(jìn)而通過大氣，土壤，水循環(huán)等富集到人體。農(nóng)藥對(duì)人類有致死、內(nèi)分泌干擾或三致效應(yīng)(致癌、致畸和致突變作用)等毒性作用，因此化學(xué)農(nóng)藥的大量使用會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[1]。精喹禾靈是一類乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑，廣泛用于大豆、甘藍(lán)、花生等作物的田間除草[2-3]。由于水圈循環(huán)、地表徑流和澆水灌溉等農(nóng)事操作，精喹禾靈有污染水體，破壞水生生物生存環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。本文通過測(cè)定農(nóng)藥對(duì)斑馬魚的LC50，明確其毒性，評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)魚類的急性毒性，提供該農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境影響的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

魚類對(duì)水體變化十分敏感，當(dāng)水體的理化性質(zhì)發(fā)生變化時(shí)，魚類能夠率先感應(yīng)到外部條件的變化而做出相應(yīng)的反應(yīng)。當(dāng)水體有毒物質(zhì)增加時(shí)魚類就會(huì)出現(xiàn)行為異常，如組織細(xì)胞病變，甚至死亡。目前進(jìn)行斑馬魚毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響，已成為一種重要的手段[4]。魚類急性毒性試驗(yàn)一般以96 h為一個(gè)試驗(yàn)周期，每隔24 h觀察魚類中毒癥狀及其死亡數(shù)目，檢測(cè)水體0 h、24 h藥液濃度，當(dāng)試驗(yàn)藥液真實(shí)濃度變化不超過理論濃度20%時(shí)可用理論濃度計(jì)算半致死濃度(即LC50)，根據(jù)LC50進(jìn)行毒級(jí)分析。

高效液相色譜由于其高效、靈敏、可靠、低檢測(cè)限等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)。馬建明[5]和丁春霞[6]等應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)蔬菜、土壤和煙葉中精喹禾靈殘留量，均取得了比較理想的結(jié)果。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1試驗(yàn)儀器與試劑

L600-P6高效液相色譜儀，北京普析通用儀器有限公司；溶解氧測(cè)定儀；ET8010水質(zhì)總硬度檢測(cè)儀。

甲醇高效液相色譜淋洗液；10%精喹禾靈乳油；97%精喹禾靈原藥；斑馬魚(市售)；試驗(yàn)用水(凈水器過濾并曝氣處理24 h以上的水)；魚餌(市售)。

1.2水體中精喹禾靈濃度檢測(cè)方法的建立

1.2.1液相色譜條件

液相色譜柱選用Pgrandsil-STC-C18；流動(dòng)相甲醇:水=80:20；檢測(cè)波長(zhǎng)237.0 nm；流速：1.0 mL/min。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制系列濃度梯度精喹禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L和2.00 mg/L)，按1.2.1液相色譜條件檢測(cè)，建立精喹禾靈標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3方法精密度考察

將上述0.10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣三次，按1.2.1液相色譜條件檢測(cè)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，變異系數(shù)，考察方法精密度。

1.2.4方法準(zhǔn)確度考察

將濃度為0.10 mg/L、1.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加到兩組試驗(yàn)水樣中平行進(jìn)樣兩次，按1.2.1液相色譜條件檢測(cè)，計(jì)算回收率，考察方法準(zhǔn)確度。

1.3急性毒性試驗(yàn)

1.3.1試驗(yàn)用魚的馴養(yǎng)

試驗(yàn)前斑馬魚在試驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d。每天喂食兩次，并及時(shí)清理水體中的魚類糞便、食物殘?jiān)退吏~等雜質(zhì)，試驗(yàn)開始前饑餓處理24 h。

1.3.2半數(shù)致死量預(yù)濃度范圍的確定

選擇較大濃度范圍(0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度投放10條斑馬魚，設(shè)三個(gè)平行組，每隔24 h時(shí)間點(diǎn)記錄斑馬魚死亡數(shù)，選取24 h斑馬魚全部死亡濃度(1.0 mg/L)和96 h無死亡濃度(0.5 mg/L)濃度范圍進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.3.3急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)七個(gè)不同濃度處理組(分別為0.500 mg/L、0.560 mg/L、0.627 mg/L、0.702 mg/L、0.787 mg/L、0.881 mg/L、0.987 mg/L)。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，挑選相同數(shù)量體長(zhǎng)均勻，健康，性成熟的斑馬魚進(jìn)行試驗(yàn)。待斑馬魚在藥液中處理0 h、24 h 、48 h、72 h、96 h 后觀察斑馬魚的中毒癥狀，記錄水體硬度、溶氧量、pH、水溫、斑馬魚的死亡數(shù)(0 h除外)。檢測(cè)不同處理組水體0 h、24 h水體藥液的實(shí)際濃度。當(dāng)試驗(yàn)藥液實(shí)際濃度變化不超過理論濃度20%時(shí)，以理論濃度計(jì)算半致死濃度(即LC50)。

全部試驗(yàn)符合《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》水體條件的質(zhì)量控制要求，即馴養(yǎng)期間斑馬魚死亡率控制在5%以下，空白組斑馬魚死亡率低于10%；光照12～14 h；水溫控制在21～25 ℃；試驗(yàn)用水pH控制在7.0左右；水體溶解氧為4.0 mg/L以上；水體硬度為200.0 mg/L左右(以碳酸鈣計(jì))。

1.3.4毒級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的劃分與數(shù)據(jù)處理

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的毒性(96 h LC50)分為四個(gè)等級(jí)即：LC50>10 a.i.mg/L為低毒；1.0a.i.mg/L

2　結(jié)果與討論

2.1精喹禾靈標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.1液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以兩次進(jìn)樣峰面積平均值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。空白水和1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜見圖2和圖3。

圖1　精喹禾靈標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　空白水液相色譜圖

圖3　1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖

2.2方法精密度與準(zhǔn)確度考察

按1.2.3和1.2.4進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1，表2，試驗(yàn)水樣(添加1.00 mg/L精喹禾靈)高效液相色譜圖見圖4。

表1　精密度測(cè)定結(jié)果

表2　準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

圖4　添加1.00 mg/L標(biāo)樣的水樣液相色譜圖

由表1、表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，標(biāo)準(zhǔn)偏差較小且方法回收率在80%～110%，符合《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，結(jié)果可靠。試驗(yàn)水樣中目標(biāo)物精喹禾靈出峰時(shí)間為16.933分，與標(biāo)準(zhǔn)溶液17.083分接近，峰形尖而對(duì)稱，且附近無雜峰干擾，說明液相條件選擇恰當(dāng)，分離效果好。

2.3試驗(yàn)水體條件

本試驗(yàn)采用半靜態(tài)法，每隔24 h更換一次藥液，并去除死魚。按設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定試驗(yàn)水體樣品在最低、最高濃度時(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)，并同時(shí)分別測(cè)定0 h、24 h時(shí)水體中精喹禾靈濃度。在試驗(yàn)時(shí)間，含最低濃度和最高濃度的精喹禾靈水體各項(xiàng)指標(biāo)均符合《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中水體條件的質(zhì)量控制要求。因此，可以認(rèn)定本次試驗(yàn)所采用的水體均符合質(zhì)量控制的要求，即本次試驗(yàn)水體條件達(dá)標(biāo)。

2.4試驗(yàn)水體中精喹禾靈實(shí)際濃度與理論濃度評(píng)價(jià)

經(jīng)測(cè)定試驗(yàn)藥液實(shí)際濃度變化不超過理論濃度20%，可用理論濃度代替實(shí)際濃度計(jì)算半數(shù)致死量。用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算不同時(shí)間的半致死濃度(LC50)和95%的置信限，結(jié)果見表3。

表3　10%精喹禾靈乳油毒性計(jì)算結(jié)果表

由計(jì)算結(jié)果知，精喹禾靈除草劑對(duì)斑馬魚96 h的LC50值為0.755 mg/L，通過對(duì)比《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，確定其毒性為高毒。

3　結(jié)　論

高效液相色譜法可用于檢測(cè)水體中精喹禾靈含量，該方法在線性范圍內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度良好。根據(jù)毒級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，10%精喹禾靈乳油對(duì)斑馬魚的LC50(96 h)值為0.755，屬高毒農(nóng)藥。目前10%精喹禾靈乳油對(duì)斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)未見有報(bào)道。于淑池等在精喹禾靈對(duì)泥鰍的急性毒性試驗(yàn)中報(bào)道出精喹禾靈對(duì)泥鰍的96 h的 LC50為4.45 mg/L,屬高毒農(nóng)藥[8]。李言等在精喹禾靈對(duì)近似鱗的試驗(yàn)中報(bào)道出24 h的LC50為 0.1278 μg/mL[9]。本研究率先以斑馬魚作為試驗(yàn)用魚采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)，研究精喹禾靈毒性，取得了可信的試驗(yàn)結(jié)果，為精喹禾靈大田使用提供參考。

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Acute Toxicity of 10% Quizalofop-p-ethyl on Zebrafish

ZHAO Xiao-hui, CHENG Cui-li, ZHOU Chun-jiao, JIANG Hong-mei

(College of science, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China)

Abstracts：The yield increasing of grain production is closely associated with the application of herbicide, during which, inevitably, environment is polluted and the organism is threaten. A semi static method was used to determinate the acute toxicity of 10% quizalofop-p-ethyl by employing Zebrafishs as experimental fish. The Zebrafishs were exposed to quizalofop-p-ethyl with different concentrations and the high performance liquid chromatography was utilized to detect the actual concentrations of quizalofop-p-ethyl in water after 0 h, 24 h, 48 h, 72 h and 96 h. The results showed the number of deaths of Zebrafishs was in the corresponding with the concentrations of quizalofop-p-ethyl. The median lethal concentration of quizalofop-p-ethyl was calculated, poisoning symptoms of zebrafishs were observed and the quizalofop-p-ethyl pesticides were judged as a highly toxic according to the classification standard of herbicide.

Quizalofop-p-ethyl; Zebrafish; acute toxicity; median lethal concentration; high performance liquid chromatography

X592

A

1001-9677(2016)016-0108-03