張耀文　周福有　徐瑞平　李銘　鄭志勇　任潤(rùn)川　孫榮剛　鄭安平

(安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院　河南 安陽(yáng)　455000)

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食管鱗癌XRCC1和ERCC1表達(dá)與同期放化療療效及預(yù)后的相關(guān)性分析

張耀文周福有徐瑞平李銘鄭志勇任潤(rùn)川孫榮剛鄭安平

(安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院河南 安陽(yáng)455000)

目的探討食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(XRCC1)和切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)的蛋白表達(dá)與同步放化療療效及預(yù)后的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)治療前98例ESCC組織標(biāo)本中XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)。Kaplan-Meier法生存分析并Logrank法檢驗(yàn)表達(dá)的生存差異，Cox模型多因素預(yù)后分析。結(jié)果XRCC1、ERCC1陽(yáng)性主要表達(dá)于細(xì)胞核，兩者表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.024，P=0.811)。XRCC1蛋白在ESCC組織和正常食管黏膜組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.1%(56/98)、13.3%(4/30)(χ2=17.702，P=0.000)。ERCC1蛋白在ESCC組織和正常食管黏膜組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.7%(36/98)、10%(3/30)(χ2=7.749，P=0.006)。XRCC1表達(dá)水平與臨床病理特征均無(wú)關(guān)(P>0.05)。ERCC1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率為44.9%(31/69)，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的17.2%(5/29)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.183，P=0.004)。XRCC1表達(dá)陽(yáng)性組、陰性組患者的近期療效和總生存期相似(χ2=0.894，P=0.344；χ2=0.266，P=0.606)。ERCC1陰性表達(dá)組的有效率為90.3%(56/62)，較陽(yáng)性表達(dá)組的80.5%(29/36)略有升高(χ2=1.888，P=0.169)。ERCC1表達(dá)陽(yáng)性組、陰性組患者的中位生存期分別為25個(gè)月(95%CI：18.559～31.441個(gè)月)、39個(gè)月(95%CI：29.313～48.687個(gè)月)，陰性組明顯高于陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.174，P=0.001)。多因素分析結(jié)果顯示ERCC1表達(dá)與生存期密切相關(guān)，是獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.010，95%CI：1.180～3.450)。結(jié)論ERCC1表達(dá)與放化療療效相關(guān)，陽(yáng)性表達(dá)的患者與不良預(yù)后有關(guān)。

食管腫瘤/放射療法；X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1；切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1；預(yù)后

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌為主，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)異常有關(guān)，包括DNA修復(fù)基因的改變。同期放化療已成為食管癌標(biāo)準(zhǔn)治療中的重要手段，但食管癌患者對(duì)放化療反應(yīng)存在明顯異質(zhì)性，生存預(yù)后有很大差異。因此，尋找可能的分子標(biāo)志物預(yù)測(cè)食管癌放化療反應(yīng)，可為指導(dǎo)食管癌個(gè)體化治療提供依據(jù)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法回顧性研究98例食管鱗癌中X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(X-ray repair cross complementing group 1，XRCC1)和切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementing 1，ERCC1)的蛋白表達(dá)水平，探討其在預(yù)測(cè)食管鱗癌同期放化療反應(yīng)及預(yù)后的臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料選取安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院2009年1月3日至2010年5月30日連續(xù)收治的98例食管鱗癌同期放化療患者，均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。癌組織標(biāo)本于治療前胃鏡下取材，組織病理學(xué)證實(shí)為鱗癌。選取30例食管正常黏膜組織作為對(duì)照。全組男56例，女42例，年齡46～72歲(中位數(shù)63歲)。根據(jù)2002年UICC食管癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期77例；T1～233例，T3～465例；N029例，N169例。分化Ⅰ級(jí)29例，Ⅱ級(jí)44例，Ⅲ級(jí)25例。頸段14例，胸上段28例，胸中段47例，胸下段9例。

1.2同期放化療放療：采用6MV-X線直線加速器行三維適形調(diào)強(qiáng)放療，GTV為CT上可見(jiàn)腫瘤；CTV為GTV上下3 cm，左右、前后外擴(kuò)0.5 cm；PTV為CTV外擴(kuò)0.5 cm外放后按解剖屏障調(diào)整。1.8～2.0 Gy/次，1次/d，5次/周，處方劑量為50～60 Gy/25～33 f。同期化療在放療第1天開(kāi)始，方案為順鉑+5-FU或順鉑+紫杉醇，共2個(gè)周期。放化療療效評(píng)價(jià)參照RECIST 1.1版標(biāo)準(zhǔn)，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)。以CR+PR計(jì)算有效率(RR)。

1.3免疫組化方法采用免疫組化EnVision兩步法分別檢測(cè)XRCC1、ERCC1蛋白在食管鱗癌組織和正常食管組織中的表達(dá)。一抗XRCC1小鼠單克隆抗體和ERCC1兔單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司，余試劑均購(gòu)自上海杰浩生物技術(shù)公司。連續(xù)切片，切片厚度約為4 μm，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。由兩位病理科主任醫(yī)師采用雙盲法閱片計(jì)數(shù)。XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性均表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒。參照Ge等[1]的評(píng)價(jià)方法，觀察腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例，腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分為0分，陰性(無(wú)染色)；1分，弱染色(淡黃色)；2分，中染色(淡棕色)；3分，強(qiáng)染色(深棕色)。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：0分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～100%?？傇u(píng)分為兩者相乘所得，≥2分為陽(yáng)性表達(dá)，<2分為陰性表達(dá)(包含缺失)。

1.4隨訪采用電子病歷查詢、電話、書信、走訪等方式進(jìn)行隨訪，總生存期(Overall survival, OS)定義為從放化療開(kāi)始至末次隨訪或死亡的時(shí)間。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析XRCC1、ERCC1與臨床病理特征之間的關(guān)系及其與放化療療效的關(guān)系。Spearman法分析XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。乘積極限法(Kaplan-Meier)法計(jì)算生存率和繪制生存曲線，并行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-rank test)檢驗(yàn)，Cox模型多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1XRCC1和ERCC1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性均表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒。XRCC1在食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%(56/98)，明顯高于正常食管黏膜組織中的13.3%(4/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.702，P=0.000)。ERCC1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為36.7%(36/98)，明顯高于正常食管黏膜組織中的10%(3/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.749，P=0.006)。見(jiàn)圖1和表1。

98例食管鱗癌組織中，XRCC1和ERCC1兩者共陽(yáng)性表達(dá)者20例，共陰性表達(dá)者26例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.059，P=0.809)。根據(jù)Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r= -0.024，P=0.811，兩者之間無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

A：XRCC1在食管鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)；B：XRCC1在食管鱗癌組織中陰性表達(dá)；C：ERCC1在食管鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)；D：ERCC1在食管鱗癌組織中陰性表達(dá)。

圖1　免疫組化法檢測(cè)XRCC1、ERCC1在ESCC組織中的表達(dá)(400×)

表2　XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.2XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系XRCC1蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位、病變長(zhǎng)度、CT分期、N分期、cTNM分期和分化程度均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。ERCC1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中陽(yáng)性表達(dá)率為44.9%(31/69)，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的17.2%(5/29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.183，P=0.004)。見(jiàn)表3。

2.3XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)與同期放化療近期療效的關(guān)系全組患者總有效率RR(CR+PR)為86.7%(85/98)，急性放射性食管反應(yīng)發(fā)生率為37.7%(37/98)，其中Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)3例，無(wú)Ⅳ級(jí)病例。XRCC1陰性表達(dá)組有效率為90.4%(38/42)，較陽(yáng)性表達(dá)組的83.9%(47/56)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.894，P=0.344)。ERCC1陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組的有效率分別為80.5%(29/36)和90.3%(56/62)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.888，P=0.169)。ERCC1表達(dá)及XRCC1表達(dá)與急性放射性食管反應(yīng)的發(fā)生均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表3　XRCC1和ERCC1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表4　XRCC1和RASSF1蛋白表達(dá)與放療近期療效的關(guān)系

2.4生存分析截止2015年12月30日，隨訪2～83個(gè)月，中位隨訪時(shí)間34個(gè)月，失訪4例，隨訪率96%。全組患者的1、3、5年生存率分別為89%、40%、17%，中位總生存期(mOS)為34.0個(gè)月。XRCC1陽(yáng)性組、陰性組患者的mOS分別為30個(gè)月(95%CI：15.821～44.179個(gè)月)、31個(gè)月(95%CI：20.714～41.286個(gè)月)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.266，P=0.606)，見(jiàn)圖2。ERCC1陽(yáng)性組、陰性組患者的mOS分別為25個(gè)月(95%CI：18.559～31.441個(gè)月)、39個(gè)月(95%CI：29.313～48.687個(gè)月)，陰性組明顯高于陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.174，P=0.001)。見(jiàn)圖3。

單因素分析顯示，近期療效和ERCC1表達(dá)與食管癌預(yù)后相關(guān)(P=0.021、0.001)，與年齡、性別、腫瘤部位、CT分期、N分期、cTNM分期、分化程度、病變長(zhǎng)度和XRCC1表達(dá)均無(wú)關(guān)(P>0.05)。Cox回歸分析結(jié)果顯示ERCC1表達(dá)是生存預(yù)后獨(dú)立影響因素(P=0.010，95%CI：1.180～3.450)，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是陰性表達(dá)組的2.017倍。見(jiàn)表5。

圖2　XRCC1表達(dá)的生存曲線圖 圖3　ERCC1表達(dá)的生存曲線圖

因素BSEWalddfSigExp(B)95.0%CI近期療效0.2290.1392.72810.0991.2570.958～1.649ERCC1表達(dá)0.7020.2746.56810.0102.0171.180～3.450

3　討論

同期放化療是食管癌的主要治療手段之一。臨床中我們常發(fā)現(xiàn)，食管癌患者放化療結(jié)束腫瘤消退及放射性食管炎的發(fā)生程度相差較大，研究提示這種差異可能與食管癌DNA損傷修復(fù)基因相關(guān)。

XRCC1位于人類染色體19q13.2～19q13.3，大小為33 kb，是重要的DNA損傷修復(fù)基因之一，其編碼產(chǎn)物參與離子輻射和化學(xué)誘變劑所致DNA損傷后的單鏈斷裂修復(fù)和堿基切除修復(fù)。多數(shù)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞XRCC1皆是低水平表達(dá)。Ang等[2]報(bào)道在頭頸部鱗癌中，XRCC1高表達(dá)的患者具有較差的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期。目前關(guān)于XRCC1的單核苷酸多態(tài)性與食管癌的易感性和放射敏感性的研究較多[3-6]，XRCC1蛋白表達(dá)與食管癌的放化療療效及預(yù)后報(bào)道較少[1]。Ge等[1]報(bào)道食管鱗癌中，XRCC1蛋白低表達(dá)與高表達(dá)的患者具有相似的總生存期。本研究結(jié)果顯示，XRCC1蛋白在食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%，明顯高于正常食管黏膜組織的13.3%，提示XRCC1蛋白表達(dá)可能參與了食管癌的發(fā)生。進(jìn)一步分析XRCC1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)XRCC1蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位、CT分期、N分期、cTNM、分化程度、病變長(zhǎng)度均無(wú)相關(guān)性；XRCC1蛋白陰性表達(dá)組的放化療有效率及mOS優(yōu)于陽(yáng)性表達(dá)組，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，但在一定程度上提示XRCC1蛋白的陰性表達(dá)患者可能更易從放化療中獲益，與劉珊珊等[7]報(bào)道結(jié)果一致。

ERCC1基因定位于人類染色體19q13.2，大小為15 kb，具有核苷酸切除修復(fù)(NER)功能，被認(rèn)為是NER修復(fù)途徑中前導(dǎo)基因。本組患者ERCC1蛋白在食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常食管黏膜組織，與文獻(xiàn)報(bào)道[8]一致，提示ERCC1的蛋白表達(dá)喪失可能在食管癌變中發(fā)揮作用。ERCC1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率44.9%高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示ERCC1蛋白表達(dá)與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Warnecke-Eberz等[9]研究發(fā)現(xiàn)ERCC1高表達(dá)患者對(duì)放化療反應(yīng)不敏感(P<0.001)。Kim等[10]報(bào)道在局部晚期食管癌患者新輔助治療中，ERCC1陰性者是病理緩解的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.001)。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明ERCC1陰性組患者的平均生存期明顯高于ERCC1陽(yáng)性組，且為獨(dú)立預(yù)后因素[10]。本研究得出一致的結(jié)論，ERCC1蛋白陰性表達(dá)組的放化療有效率略高于陽(yáng)性表達(dá)組，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但一定程度說(shuō)明ERCC1陰性組患者的放化療有效率高。單因素結(jié)果顯示ERCC1陰性組的mOS為39個(gè)月(95%CI：29.313～48.687個(gè)月)，明顯高于陽(yáng)性組的25個(gè)月(95%CI：18.559～31.441個(gè)月)；Cox回歸分析結(jié)果顯示ERCC1表達(dá)是生存預(yù)后獨(dú)立影響因素(P=0.010，95%CI：1.180～3.450)，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是陰性表達(dá)組的2.017倍，提示ERCC1表達(dá)與放化療預(yù)后相關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)代表了不良的預(yù)后。

綜上所述，XRCC1、ERCC1蛋白的表達(dá)情況可能在食管癌的發(fā)生中起一定作用。XRCC1蛋白陰性表達(dá)患者可能更易從放化療中獲益，ERCC1陰性表達(dá)與放化療療效相關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)代表了不良的預(yù)后。

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Analysis of correlation between protein expression of XRCC1 and ERCC1 with efficacy of concurrent radiochemotherapy and the prognosis of patients with esophageal aquamous cell carcinoma

Zhang Yaowen, Zhou Fuyou, Xu Ruiping, Li Ming, Zheng Zhiyong, Ren Runchuan,Sun Ronggang, Zheng Anping

(TumorHospitalofAnyang,Anyang455000,China)

ObjectiveTo analyze the correlation between protein expression of X-ray repair cross complementing group 1(XRCC1) and excision repair cross complementing 1( ERCC1) with efficacy of concurrent radiochemotherapy(CRT) and the prognosis of patients with esophageal aquamous cell carcinoma(ESCC). MethodsImmunohistochemical SP method was used to measure the protein expression of XRCC1 and ERCC in 98 ESCC tissue samples before CRT. The Kaplan-Meier method was used for survival analysis, and the log rank test was used for analyzing the survival difference between negative and positive samples. The Cox model was used for multivariate prognostic analysis. ResultsXRCC1 and ERCC1 protein were mainly expressed in the nucleus in ESCC. There was no correlation between them(r=-0.024,P=0.811). The positive expression rate of XRCC1 protein in ESCC tissues and normal esophageal tissues were 57.1%(56/98) and 13.3%(4/30) respectively (χ2=17.702,P=0.000). The positive expression rate of ERCC1 protein in ESCC tissues and normal esophageal tissues were 36.7%(36/98) and 10%(3/30) respectively(χ2=7.749,P=0.006). The level of ERCC1 was not correlated with clinical pathologic characteristics (P>0.05). The positive expression rate of ERCC1 protein in negative lymphnode group was 44.9% (31/69), higher than 17.2%(5/29) in positive lymphnode group, and the difference was statistically significant (χ2=8.183,P=0.004). The patients with positive XRCC1 expression and negative XRCC1 expression had similar short-term responses(χ2=0.894,P=0.344) as well as similar survival rates(χ2=0.266,P=0.606). The RR of ERCC1 negative expression group was 90.3%(56/62), and the RR of ERCC1 positive expression group was 80.5%(29/36), but there was no statistically significant difference (χ2=1.888,P=0.169). The median overall survival periods of ERCC1 negative expression group was 39 months (95%CI: 29.313～48.687 months), higher than 25 months(95%CI: 18.559～31.441 months) in positive expression group, the difference was statistically significant (χ2=10.174,P=0.001). In multivariate analysis, the expression of ERCC1 was closely correlated with overall survival and was the independent prognostic factor (P=0.010, 95%CI: 1.180～3.450). ConclusionERCC1 expression was associated with the efficacy of CRT, and the patients with ERCC1 positive expression had poor prognosis.

esophageal neoplasms/radiotherapy; X-ray repair cross complementing group 1; excision repair cross complementing 1; prognosis

安陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014)。

鄭安平，E-mail：zhenganping3@126.com。

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2016.08.005

2016-02-18)