馬璐璐，吳　杰，呂　中

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

納米氧化銅與慶大霉素協(xié)同抗MRSA作用的研究

馬璐璐，吳杰，呂中*

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

篩選具有協(xié)同抗耐藥菌活性的納米材料與抗生素組合是解決抗生素耐藥問題的有效手段之一.采用水熱法合成粒徑為20 nm的氧化銅納米顆粒，通過抑菌圈法測定對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）具有明顯耐藥性的抗生素慶大霉素、環(huán)丙沙星、哌拉西林、頭孢呋辛和頭孢噻肟與納米氧化銅的聯(lián)合抗菌作用，篩選具有協(xié)同作用的納米氧化銅-抗生素組合.通過棋盤法測定納米氧化銅-抗生素組合的部分抑菌濃度指數(shù)（FIC），并在此基礎(chǔ)上測定兩者對MRSA的時間-殺菌曲線.實驗結(jié)果表明納米氧化銅與慶大霉素聯(lián)用比兩者單獨使用的抑菌圈面積增大0.88倍，F(xiàn)IC值小于0.5，兩者聯(lián)用能夠顯著抑制細菌生長.

納米氧化銅；慶大霉素；MRSA；協(xié)同抗菌作用

1　引言

由于抗生素的廣泛使用甚至濫用，許多細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，使得抗生素的使用遇到瓶頸，開發(fā)新的能有效對抗耐藥菌的藥物迫在眉睫［1-3］.近年來隨著人們對納米材料抗菌作用及機理的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)納米材料通過多種途徑作用于細菌，使細菌不易產(chǎn)生耐藥性［4］.在無機納米抗菌材料中，納米銀由于具有較強的抗菌作用被廣泛研究和使用，但納米銀對人體及環(huán)境都具有較強毒性，人們開始將目光轉(zhuǎn)向毒性較低的金屬氧化物，如納米氧化鋅、氧化鎂、氧化銅及二氧化鈦等［5］，這些金屬氧化物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、能長時間發(fā)揮抗菌作用.其中，氧化銅是一種多功能的納米材料，如用于儲磁、能量轉(zhuǎn)換、電極、電池及催化劑等，其價格比銀低，化學(xué)物理性質(zhì)穩(wěn)定［6］，此外，納米氧化銅對大腸桿菌、枯草桿菌、沙門桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌等具有較好的抗菌活性［7-8］.

將納米材料與抗生素聯(lián)合抗菌，則納米材料有可能破壞耐藥菌對抗生素的耐藥機制，使抗生素重新發(fā)揮抗菌作用.目前有關(guān)納米材料與抗生素協(xié)同抗菌作用研究報道較少，McShan［9］等報道新霉素與納米銀聯(lián)用對鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）具有明顯的協(xié)同抗菌效果，Luo［10］等報道納米氧化鋅和頭孢曲松鈉聯(lián)合作用具有協(xié)同作用.但有關(guān)氧化銅與抗生素的協(xié)同作用還未見報道.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是臨床最常見的耐藥菌，MRSA感染會引起肺炎、偽膜性腸炎、敗血癥、膿毒血癥等疾病發(fā)生，MRSA成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一［2］.尋找能有效抗MRSA感染的抗生素與納米材料組合，對治療MRSA引起的感染具有重要意義.

本研究采用水熱法合成納米氧化銅，測定其與對MRSA具有顯著耐藥性的抗生素的聯(lián)合抗菌效果，篩選具有協(xié)同抗菌作用的抗生素與納米氧化銅組合，以期為抗MRSA感染的新藥研發(fā)提供實驗基礎(chǔ).

2　實驗部分

2.1試劑與儀器

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（S.aureus，ATCC 9118）由華中科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；MRSA由武漢市第三人民醫(yī)院提供.醋酸銅［Cu（CH3COO）2］購自上海阿拉丁試劑有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）試劑購自Sigma公司；慶大霉素（GEN）、頭孢呋辛（CXM）、頭孢噻肟（CTX）、哌拉西林（PIP）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿奇霉素（AZI）、萬古霉素（VAN）和復(fù)方新諾明（SXT）抗生素紙片購自O(shè)xoid公司；硫酸慶大霉素（Gentamicin Sulfate）注射液購自宜昌人福藥業(yè)有限公司，純度＞99.9%；Mueller-Hinton（MH）培養(yǎng)基購自奧博星有限公司.

722E可見分光光度計，天津市普瑞儀器有限公司生產(chǎn)；D8 ADVANCE型X-射線衍射儀（XRD），德國Bruker公司生產(chǎn)；S-4800 FEG型掃描電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi公司生產(chǎn).

2.2實驗方法

2.2.1納米氧化銅的合成與表征將2 mmol的Cu（CH3COO）2放入含30 mL HEPES溶液的50 mL圓底燒瓶中，調(diào)pH為10.4，將混合物攪拌并超聲處理，直到Cu（CH3COO2）完全溶解在HEPES溶液中.然后將溶液倒入50 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜，120℃反應(yīng)6 h.待反應(yīng)釜冷卻至室溫后，離心，用去離子水洗滌5次，無水乙醇洗滌1次，60℃烘箱烘干，收集樣品.

所制備的納米氧化銅組分采用XRD進行表征，Cu Ka=0.154 06 nm，掃描范圍為20～80°；利用SEM對納米氧化銅的形貌及粒徑分布進行表征，操作壓力為5 kV.

2.2.2抑菌圈測定實驗方法見參考文獻［11］.在MH固體培養(yǎng)基上均勻涂布100 mL 108CFU/mL MRSA菌液，貼上抗生素紙片，35℃恒溫培養(yǎng)18 h后，測量抑菌圈的直徑.

為測定CuO與抗生素聯(lián)用的抗菌活性，可在抗生素紙片上滴加10 mL 1 mg/mL CuO溶液，然后內(nèi)貼在涂布菌液的固體培養(yǎng)基上，35℃恒溫培養(yǎng)18 h后，測量抑菌圈的直徑.所有實驗重復(fù)3次.

2.2.3納米氧化銅與抗生素聯(lián)用的部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）測定采用稀釋法測定CuO與GEN分別作用MRSA的最低抑菌濃度（MIC）［12］.將CuO 與GEN在4×MIC到1/32×MIC抑菌濃度范圍內(nèi)分別倍比稀釋成8個抑菌濃度，將不同抑菌濃度的兩種抗菌藥物按棋盤法設(shè)計［13］，兩兩組合加入試管，每種抗菌藥物取0.5 mL，再將1 mL抑菌濃度為1× 106CFU/mL菌液與藥物混合，35℃恒溫培養(yǎng)18 h，記錄澄清試管的兩種抗菌藥物的MIC值，按下式計算FIC指數(shù).以不加抗菌劑的試管作為空白對照，實驗重復(fù)3次.FIC＜0.5，為協(xié)同作用；0.5≤FIC＜1，為部分協(xié)同作用；FIC=1.0，為相加作用；1＜FIC＜4，為無關(guān)作用；FIC≥4，為拮抗作用［14］.計算FIC公式如下：

2.2.4納米氧化銅與GEN聯(lián)用對MRSA的時間-殺菌曲線將8 g/mL CuO、32 g/mL GEN或8 g/mL CuO+32 g/mL GEN混合液分別與1×106CFU/mL菌液混合，在35℃培養(yǎng)，取不同時間點培養(yǎng)液10 μL，數(shù)菌落，繪制菌落-時間曲線.以未加抗菌藥物的培養(yǎng)組作為對照.

3　結(jié)果與討論

3.1納米氧化銅的合成與表征結(jié)果

圖1（a）是所合成CuO樣品的XRD圖.所合成樣品的衍射峰與單斜晶系的CuO標準卡片圖譜（JCPDS 05-0661）相一致，且沒有雜峰出現(xiàn)，衍射峰均有較高的強度，說明合成的樣品為結(jié)晶度較高CuO.圖1（b）為水熱條件下合成的CuO的SEM 圖.從圖中可以看出，所合成的CuO為均一的球型結(jié)構(gòu)，粒徑在20 nm左右.

圖1　納米氧化銅（a）XRD圖譜，（b）SEM圖Fig.1（a）XRD pattern and（b）SEM image of CuO nanoparticles

3.2MRSA的耐藥譜

所選取的8種抗生素中，GEN屬于氨基糖苷類抗生素，PIP、CTX和CXM屬于-內(nèi)酰胺類抗生素，CIP屬于喹諾酮類抗生素，AZI屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，VAN屬于糖肽類抗生素，SXT屬于磺胺類抗生素.8種抗生素對S.aureus和MRSA的抑菌圈如圖2和表1所示.由圖可知，普通的S.aureus對八種抗生素CXM、CTX、PIP、CIP、GEN、AZI、VAN和SXT均敏感，而MRSA對其中的5種抗生素CXM、CTX、PIP、CIP和GEN均出現(xiàn)耐藥.MRSA是醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌之一，其對多種抗生素耐藥［15］，這與我們的實驗結(jié)果一致.

圖2　不同抗生素對S.aureus和MRSA的敏感性實驗Fig.2　Susceptibility of antibiotics against S.aureus and MRSA

表1　不同抗生素對S.aureus和MRSA的抑菌圈Tab.1　Innhibition zones of different antibiotics against S.aureus and MRSA　mm

3.3納米氧化銅與抗生素聯(lián)用的抗菌活性

上述對MRSA耐藥的5種抗生素與CuO組合后的抑菌圈測試結(jié)果如圖3和表2所示.由圖可知，CuO單獨作用于MRSA，沒有明顯抑菌圈，當CuO與GEN結(jié)合后，抑菌圈面積較單獨的抗生素抑菌圈面積增加了0.88倍，而其他抗生素與CuO聯(lián)用抑菌圈面積則沒有明顯增大，說明只有CuO 和GEN對MRSA具有較好的協(xié)同抗菌效果.

圖3　CuO與不同抗生素結(jié)合對MRSA的抑菌圈Fig.3　Innhibition zones of different antibiotics againstMRSA in presence and absence of CuO

表2　CuO與不同抗生素結(jié)合對MRSA的抑菌圈直徑Tab.2　Zone of inhibition（mm）of different antibiotics against MRSA（in absence and in presence of CuO）　mm

3.4納米氧化銅與抗生素聯(lián)用的FIC值

CuO與GEN單獨作用于MRSA的MIC分別是64 g/mL和128 g/mL，將兩者混合后對MRSA的MIC為8 g/mL CuO+32 g/mL GEN，由公式計算得到FIC為0.375，小于0.5，說明CuO與GEN聯(lián)用具有協(xié)同抗菌效果.在8 g/mL CuO存在下，GEN對MRSA的MIC從128 g/mL降為32 g/mL.

3.5納米氧化銅與抗生素聯(lián)用對MRSA的時間-殺菌曲線

通過測定FIC濃度下藥物對MRSA的時間-殺菌曲線，進一步評價CuO與GEN單獨使用與聯(lián)合作用的抑菌作用.由圖4可知，8 mg/mL CuO和32 mg/mL GEN單獨作用MRSA時抗菌作用很弱.兩者聯(lián)合使用時，完全抑制細菌生長，與CuO與GEN單獨作用相比，兩者聯(lián)用使菌落數(shù)減小3.8×log10CFU/mL，進一步說明CuO與GEN聯(lián)用對MRSA具有協(xié)同抗菌作用.

圖4　8 mg/mL氧化銅和32 mg/mL慶大霉素單獨或聯(lián)合使用對MRSA的時間-殺菌曲線Fig.4　Time-Kill curves of 8 μg/mL CuO and 32 μg/mL GEN alone or in combination against MRSA

4　結(jié)　語

在對S.aureus敏感，對MRSA耐藥的5種抗生素GEN、CXM、CTX、PIP和CIP中，CuO只與GEN具有顯著的協(xié)同抗MRSA作用.兩者協(xié)同作用機理有待進一步研究.

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本文編輯：張瑞

Synergistic Antibacterial Effection of CuO Nanoparticles Combined with Gentamicin Against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus

MA Lulu，WU Jie，LYU Zhong*
School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

Screening the combination of antibiotics and nanomaterials which has synergy antibacterial activity against drug-resistant bacteria is one of the effective ways to solve the problem of antibiotic resistance.The CuO nanoparticles with size around 20 nm were prepared by the hydrothermal method.The antibacterial effects of the CuO combined with antibiotics of gentamicin，ciprofloxacin，piperacillin，cefuroxime and cefotaxime，which are resistant to methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）were determined by the inhibition zone test. The fractional inhibitory concentration index（FIC）of the combination of CuO and gentamycin was determined by the checkerboard method，and time-kill curves against MRSA were also determined.The results show that the inhibition zone's area of the combination increases by 88%than that of the two components used separately，and FIC value is less than 0.5.The combination of CuO with gentamycin significantly inhibits the growth of MRSA.

CuO nanoparticles；gentamicin；MRSA；synergistic antibacterial effect

R446.1

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2016.03.004

1674-2869（2016）03-0226-05

2016-03-03

國家自然科學(xué)基金（21371139）

馬璐璐，碩士研究生.E-mail：330928156@qq.com

呂中，博士，教授.E-mail：zhonglu@wit.edu.cn