李曉堯　張　丹　湯麗芝　史亞軍　王昌利

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸 陽712046)

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·方藥縱橫·

HPLC法同時(shí)測定秦皮中四種成分含量的研究

李曉堯張丹湯麗芝史亞軍王昌利

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸 陽712046)

目的：建立同時(shí)測定秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷的HPLC法，為秦皮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供定量方法基礎(chǔ)。方法：色譜柱：Betasil-C18(250mm×4.6mm，5μm,LOT：13697)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(13∶87)，檢測波長：334nm，柱溫：30℃，流速：1ml/min。結(jié)果：秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷分別在0.3090～3.0900μg、0.1275～1.2750μg、0.0276～0.2760μg、0.0540～0.5400μg(r=0.999)呈線性關(guān)系。結(jié)論：本法簡單、快速，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，色譜峰分離度好。

主題詞色譜法，高壓液相秦皮

ABSTRACT

Objective:To establish a simultaneous determination aesculin , aesculetin, fraxin, fraxetin of HPLC method, provide a quantitative method for quality evaluation of fraxini cortex . Methods: Chromatographic column: Betasil - C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm，the LOT: 13697), mobile phase: acetonitrile - 0.1% phosphoric acid aqueous solution (13∶87) , detection wavelength: 334 nm, column temperature:30℃, the flow rate: 1ml/min. Results: Aesculin, aesculetin , fraxin , fraxetin in 0.3090～3.0900μg, 0.1275～1.2750μg, 0.0276～0.2760μg, 0.0540～0.5400μg (r=0.999) have a good linear relationship. Conclusion: This method is simple, rapid, good reproducibility, high accuracy, good chromatographic peak separation.

秦皮來源為木犀科植物苦櫪白蠟樹、白蠟樹、尖葉白蠟樹或宿柱白蠟樹的干燥枝皮或干皮。主產(chǎn)于陜西、河北、河南、山西、遼寧、吉林等地[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,其主要功效有清熱燥濕、平喘止咳、收澀止痢、抗菌、明目,常用于治療泄瀉、眼部疾病、感染性疾病、原發(fā)性高尿酸血癥等。秦皮的化學(xué)成分包括香豆素類、酚類、皂苷、鞣質(zhì)、生物堿等，其中香豆素類成分為秦皮的主要有效成分[2]。近年有關(guān)秦皮的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)秦皮具有抗炎、鎮(zhèn)痛及止咳祛痰的作用[3-4]。有關(guān)秦皮中香豆素類成分的含量測定，早期有文獻(xiàn)報(bào)道以紫外分光光度法及薄層掃描法定量分析秦皮甲素與秦皮乙素的含量，《中國藥典》及近年來多采用高效液相色譜法測定秦皮甲素、秦皮乙素的含量，對(duì)秦皮甲素、秦皮乙素的總含量做出了規(guī)定[5]。本文實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用HPLC法同時(shí)測定秦皮飲片中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷四種香豆素類單體成分的含量，為后期建立秦皮飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供含量測定方法學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥1 .1儀器U3000型反相高效液相色譜儀(德國戴安)；AR1140型電子天平(萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KH-400-KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；QE-300g粉碎機(jī)(浙江屹立工貿(mào)有限公司)。

1.2試藥秦皮甲素、秦皮乙素及對(duì)照品，(購于中國食品藥品檢定研究院，批號(hào): 秦皮甲素 110740-200104、秦皮乙素110741-200607，秦皮素111731-200501、秦皮苷對(duì)照品由西瑪實(shí)驗(yàn)室提供)；甲醇、磷酸均為分析純(成都市科龍化工有限公司)；乙腈為色譜純(賽默飛世爾中國有限公司)；水為純凈水。秦皮飲片分別來源于興盛德飲片廠及西安市萬壽路藥材市場，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為尖葉白蠟樹。

2方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱：Betasil C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(13∶87)，檢測波長：334nm，柱溫：30℃，流速：1ml/min，進(jìn)樣量為10μl。

2.2對(duì)照品溶液的配制精密稱取秦皮甲素對(duì)照品、秦皮乙素對(duì)照品、秦皮素對(duì)照品、秦皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并配制成每1ml含秦皮甲素對(duì)照品、秦皮乙素對(duì)照品、秦皮素對(duì)照品、秦皮苷對(duì)照品分別為0.1545mg、0.0255mg、0.0138mg、0.0270mg的對(duì)照品混合溶液。

2.3供試品溶液配制[1]取約0.5g的樣品粉末(使通過三號(hào)篩)，精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，再精密加入50ml甲醇，密塞，稱定總重量，加熱回流1h，放冷，拆下，再稱定總重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.4方法學(xué)考察2.4.1專屬性：秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷對(duì)照品溶液色譜圖及樣品中4種成分的色譜圖見圖1，結(jié)果顯示，各組分分離度好，無干擾。

1.秦皮甲素　 2.秦皮苷 3.秦皮乙素　4.秦皮素

2.4.2線性關(guān)系的考察：分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、15μl、20μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1。

表1　 回歸方程與線性范圍(n=3)

2.4.3精密度：取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，精密吸取10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD值。得秦皮甲素RSD=1.04%；秦皮乙素RSD=0.29%；秦皮素RSD=0.57%；秦皮苷RSD=0.52%，結(jié)果表示本法具有良好的精密性。

2.4.4重復(fù)性：取樣品1按“2.3”項(xiàng)下方法，配制5份平行的供試品溶液，精密吸取10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算RSD值。得秦皮甲素RSD=0.56%；秦皮乙素RSD=1.82%；秦皮素RSD=1.32%；秦皮苷RSD=1.08%，各成分RSD均小于2%，表明了本法的重復(fù)性良好。

2.4.5穩(wěn)定性：取樣品1的供試品溶液，分別在室溫放置0h、2h、4h、6h、8h、12h，精密吸取10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算RSD值。得秦皮甲素RSD=0.62%；秦皮乙素RSD=1.68%；秦皮素RSD=1.94%；秦皮苷RSD=1.99%，各成分RSD均小于2%，說明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6加樣回收率：取同一批樣品粉末(過三號(hào)篩)約0.25g(樣品中含秦皮甲素1.04%,秦皮乙素0.27%，秦皮素0.09%，秦皮苷0.67%)，精密稱定6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.60mg/ml秦皮甲素、0.68mg/ml秦皮乙素、0.23mg/ml秦皮素和1.68mg/ml秦皮苷對(duì)照品溶液各1ml(揮干溶劑)，再精密加入50ml甲醇，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，根據(jù)峰面積，計(jì)算各成分的平均加樣回收率及RSD。結(jié)果見表2。

表2　4種成分的加樣回收率(n=6)

2.5樣品的測定取10批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備各樣品供試液，依“2.1”行下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。根據(jù)2015版《中國藥典》的規(guī)定，編號(hào)為4、5的樣品含量不符合規(guī)定，其余8批測定結(jié)果顯示，秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷的總含量不低于1.1%。

表3　樣品的含量測定結(jié)果

3討論關(guān)于供試品的制備，2015版《中國藥典》中采用加熱回流提取，有文獻(xiàn)采用超聲提取法，實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了加熱回流提取的與超聲提取供試品溶液的含量測定，表明加熱回流提取制備的供試品溶液的含量測定明顯高于超聲提取，故本法最終確定以加熱回流制備供試品溶液。測定波長的選擇，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)及藥典規(guī)定，對(duì)比了254nm及334nm波長下的色譜峰，結(jié)果顯示：以334nm為檢測波長的色譜峰峰形明顯比254nm檢測波長下的峰形好。對(duì)比其他相關(guān)的秦皮含量測定研究，本文采用的HPLC法的優(yōu)點(diǎn)在于流動(dòng)相配比簡單，在等度條件下即可同時(shí)測定出四種成分的含量，方法簡單可控，重復(fù)性好，且色譜峰峰形良好，分離度高。2015版《中國藥典》中用HPLC法測定了秦皮甲素及秦皮乙素的含量，且規(guī)定兩種成分在秦皮飲片中總量不得少于0.8%,但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，10批樣品的測定結(jié)果表明，有編號(hào)為4、5號(hào)的兩批樣品不符合藥典規(guī)定，其余8批中測定結(jié)果顯示秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素的總含量最低為1.1%。且發(fā)現(xiàn)秦皮甲素、秦皮苷兩種苷類香豆素成分的含量均高于秦皮乙素、秦皮素兩種苷元含量的3倍。

秦皮中秦皮甲素、秦皮苷為苷類香豆素成分，而秦皮乙素、秦皮素是秦皮甲素、秦皮苷的苷元成分，因此新鮮秦皮中秦皮甲素、秦皮苷含量明顯多于秦皮乙素、秦皮素，若保存不當(dāng)或炮制工藝不當(dāng)，秦皮甲素、秦皮苷易被水解為秦皮乙素、秦皮素，而使測定的含量有所改變，本文采用HPLC法同時(shí)測定秦皮中甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷的含量，可以更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)秦皮質(zhì)量，為建立秦皮飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典,一部 [S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2015:271.

[2]劉國宇,周軍輝,崔新愛,等.秦皮的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2016,31(2):220-222.

[3]任茜,陳國聯(lián),李萬波.秦嶺白蠟樹屬藥用植物體外抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī),2012,33(6):756-757.

[4]楊春雪,汪業(yè)菊,謝明杰.秦皮素抑菌活性及其機(jī)制研究[J].免疫學(xué)研究,2012,28(8);703-705.

[5]葉迎,柏冬,包強(qiáng)，等.秦皮提取物中香豆素類成分含量測定方法研究[J].2015,8(22),83-85.

(收稿2016-02-25；修回2016-05-12)

HPLC method for simultaneous determination of four component content in fraxini cortex

Shaanxi University of Tranditional Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Li Xiaoyao Zhang Dan Tang Lizhi et al

Chromatography, high pressure liquidFraxini cortex

R681.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.063