史迎莉　許小凡　劉　芳　張曉芹　張　紅

陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實驗中心(咸陽712046)

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四逆散對慢性胰腺炎模型小鼠MDA和SOD表達水平的影響*

史迎莉許小凡劉芳張曉芹張紅△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實驗中心(咸陽712046)

目的：觀察四逆散對慢性胰腺炎小鼠胰腺組織中MDA和SOD的影響。方法：48只昆明小鼠，隨機分為3組。模型組與四逆散組經(jīng)尾靜脈一次性注射二氯二丁基酯(DBTC) 0.8mg/100g體重，并用10%的乙醇代替飲用水，誘發(fā)小鼠慢性胰腺炎。造模后72h，治療組給予四逆散6g/(kg·d)灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。分別于造模后2周、8周，處死小鼠，取胰腺組織，檢測MDA和SOD的變化，HE染色觀察胰腺病理學(xué)改變。結(jié)果：造模后，模型組胰腺MDA的水平持續(xù)升高，而SOD活性持續(xù)降低，二者于相應(yīng)時間點的對照組相比差異顯著。HE染色結(jié)果顯示，造模后2周，模型組小鼠胰腺可見炎細胞浸潤，胰腺小葉間纖維化;造模后8周，可見腺泡細胞和胰島明顯減少，大量炎細胞浸潤，胰腺實質(zhì)壞死，被纖維組織替代；四逆散治療后，與模型組相比，相應(yīng)時間點胰腺組織MDA的水平下降，而SOD的水平有所升高;相應(yīng)時間點胰腺組織的損傷有所減輕。結(jié)論：四逆散通過調(diào)節(jié)胰腺組織MDA和SOD的活性水平來防治DBTC聯(lián)合乙醇所致慢性胰腺炎小鼠的胰腺炎纖維化。

主題詞胰腺炎四逆散

慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis，CP)是由多種原因引起的胰腺實質(zhì)出現(xiàn)不可逆的慢性炎癥，胰腺間質(zhì)纖維化，胰腺腺泡和胰島萎縮或消失，引起胰腺內(nèi)、外分泌功能不全，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的上腹痛[1]。近年來，CP在我國發(fā)病率不斷增高，臨床上無特異性的療法，僅限于對癥治療或緩解癥狀，治療效果不佳，臨床難以治愈[2]。本實驗采用小鼠尾靜脈注射二氯二丁基酯(Dibutyltin Dichloride，DBTC)，同時飲用10%乙醇誘發(fā)小鼠CP模型，給予四逆散灌胃，觀察其對CP小鼠胰腺丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平的影響，探討四逆散防治CP的作用機制。

1材料1.1試劑與儀器四逆散(柴胡6g，枳殼、白芍、黃芩、木香各5g，炙甘草3g)中藥飲片購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)一附院中藥房，常規(guī)水煎濃縮至29ml(1g生藥/ml)，分裝后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。二氯二丁基?DBTC)購自Sigma-Aldrich；小鼠SOD和MDA檢測試劑盒購于南京建成生物所；組織勻漿機(德國IKA)；酶標儀(Bio-Tek，ELX808)；高速冷凍離心機(德國eppendorf,5430R)，顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(德國蔡司Axio Imager，A2)。

1.2動 物昆明小鼠48只，雄性，6～8周齡，體重20～28g；購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(動物合格證號：0001249)。

2方法2.1分組及造模將48只小鼠隨機分為3組(n=16)，即對照組(尾靜脈注射0.9% NaCl+正常飲水)；模型組(尾靜脈注射DBTC+飲用10%乙醇)；四逆散組(尾靜脈注射DBTC +飲用10%乙醇+四逆散灌胃)。模型復(fù)制：48只昆明小鼠，保持室溫20℃～25℃，自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境后用于實驗。將80mg DBTC溶于30ml無水乙醇，緩緩加入10ml甘油，再滴加生理鹽水至50ml，搖至清亮(1.6g/l),經(jīng)尾靜脈一次性注射DBTC(0.8mg/100g)后，用10%乙醇代替飲用水，常規(guī)飼料飼喂，復(fù)制小鼠CP模型。造模后第3天，隨機分為模型組和四逆散組，模型組飲用10%乙醇，標準飼料飼喂；四逆散組給予四逆散濃縮液生藥含量6g/(kg·d),0.2～0.4ml/只/d灌胃，1劑/d，分別灌胃2周、8周，同時飲用10%乙醇。對照組按照50μl/10g體重經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，之后常規(guī)攝食、飲水。對照組和模型組在相同的時間點給予等量生理鹽水灌胃。

2.2標本采集與檢測分別于造模后2周、8周乙醚吸入麻醉，處死實驗動物，完整摘取胰腺，一部分胰腺用10%甲醛浸泡固定，行HE染色并觀察病理學(xué)改變；另一部分新鮮胰腺，液氮速凍后，-80℃冰箱保存，制備組織勻漿，進行SOD和MDA活性檢測。

2.3胰腺組織的病理學(xué)改變甲醛固定后的胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，進行蘇木素-伊紅染色，鏡下觀察各組胰腺的形態(tài)學(xué)改變，并拍照采集圖像。

2.4胰腺MDA和SOD的檢測取50mg新鮮胰腺組織置于EP管中，加入緩沖液，用組織勻漿器勻漿，高速冷凍離心機4℃，10000r/min，離心10min，吸取上清，按試劑盒要求檢測胰腺組織MDA和SOD表達水平。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法用均數(shù)±標準差表示實驗數(shù)據(jù)，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理分析，各組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果3.1胰腺組織的病理學(xué)變化如圖1所示，造模后2周，模型組小鼠胰腺可見少量胰腺腺泡細胞萎縮、壞死，炎細胞浸潤，小葉間可見少量纖維化；造模后8周,可見胰腺腺泡細胞及胰島萎縮、消失，大量纖維組織增生。但是四逆散治療組，在相同時間點胰腺的炎癥損傷程度及纖維化程度明顯減輕。

A:對照組2周；B:對照組8周；C:模型組2周；D：模型組8周；E：四逆散組2周；F：四逆散組8周

3.2胰腺組織MDA和SOD活性變化小鼠尾靜脈注射DBTC造模后，胰腺組織MDA水平隨著造模時間的延長，持續(xù)升高；而SOD水平則隨著造模時間延長持續(xù)降低，與對照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)；四逆散組MDA水平與相同時間點模型組相比明顯降低，而SOD水平與相同時間點模型組相比明顯升高，差異具有顯著性 (P<0.01)。

4討論CP病因復(fù)雜，如長期飲酒或膽道疾病等可引起胰腺實質(zhì)慢性炎癥，最終被纖維結(jié)蹄組織代替[1]。SOD是生物體內(nèi)廣泛存在的一種金屬酶，能將超氧陰離子催化為過氧化氫和氧氣，清除體內(nèi)氧化自由基，使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡，起到重要的抗氧化作用[3]。MDA是氧自由基作用于機體脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物，其含量高低可間接反映機體內(nèi)氧自由基的含量及機體受損傷程度[4]。SOD能夠清除過量的氧自由基、消除炎癥，具有極強的抗炎作用[5]。慢性胰腺炎就是一種不可逆的炎癥性疾病，體內(nèi)堆積過多的氧自由基，如不能及時被清除，將與細胞膜發(fā)生反應(yīng)，生成過多的MDA引起炎癥反應(yīng)和組織損傷[6]。SOD能夠抑制炎癥的進展、具有抗氧化的作用，從而減輕胰腺纖維化程度，因此檢測SOD含量對慢性胰腺炎的診斷和治療有客觀價值。

近期實驗研究發(fā)現(xiàn)，在注射 DBTC 基礎(chǔ)上聯(lián)合飲用10% 乙醇的造模方法復(fù)制小鼠CP模型，這種方法成功率高、成本較低，造成的小鼠CP模型較符合人慢性胰腺炎的病理特征和血清學(xué)改變，適合做藥物治療研究[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，CP發(fā)展過程中機體的抗氧化能力不斷降低。四逆散灌胃治療后，可通過抗氧化作用，減輕CP小鼠的胰腺損傷程度。

CP屬于中醫(yī)的“腹痛”范疇，多為脾虛、肝郁氣滯，血瘀所致。四逆散出自《傷寒論》，是疏肝透解，活血化瘀，緩急止痛的要方。本實驗在原方：柴胡、白芍、枳殼、甘草的基礎(chǔ)上加入黃芩、木香。近期藥理研究顯示,柴胡皂甙具有很強的抗炎作用及抗纖維化作用；黃芩苷具有抗氧化及清除氧自由基的能力；芍藥苷具有抗自由基損傷的作用，能減少SAP大鼠胰腺促炎因子的釋放，對大鼠SAP具有治療作用[8]。枳殼、甘草酸亦具有抗炎、抗氧化作用,木香具有行氣利膽，鎮(zhèn)痛的作用。我們的實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，四逆散治療組小鼠，胰腺組織的MDA在2周，明顯下降，并一直維持在較低水平，而SOD的水平在治療后逐漸升高。提示四逆散能夠通過提升CP小鼠胰腺的抗氧化能力，減輕CP小鼠的胰腺損傷程度及胰腺纖維化的程度，為四逆散用于臨床防治CP提供了實驗根據(jù)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會胰腺外科學(xué)組. 慢性胰腺炎診治指南(2014)[J]. 中國實用外科雜志，2015，35(3)：277-282.

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(收稿2016-03-30；修回2016-05-15)

*陜西省咸陽市科技局自然科學(xué)基金[2011K13-06(1)]

R657.5

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10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.072