朱融和，陳慧瑤，莊強(qiáng)，江松福

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.兒科；2.血液內(nèi)科）

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人腸三葉因子重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在CHO/dhfr-細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)

朱融和1，陳慧瑤2，莊強(qiáng)2，江松福2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.兒科；2.血液內(nèi)科）

目的：構(gòu)建人腸三葉因子（hITF）重組真核表達(dá)載體，并檢測(cè)其在CHO/dhfr-細(xì)胞中的表達(dá)。方法：通過重疊延伸PCR法獲得hITF cDNA片段，將目的基因插入真核表達(dá)載體pIRES/dhfr，得到重組真核表達(dá)載體pIRES/hITF/dhfr；經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO/dhfr-細(xì)胞系；用RT-PCR及ELISA法檢測(cè)hITF的表達(dá)。結(jié)果：成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRES/hITF/dhfr，并建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，成功地表達(dá)了目的基因。結(jié)論：成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRES/hITF/dhfr，并在CHO/dhfr-細(xì)胞中分泌表達(dá)hITF蛋白，為進(jìn)一步進(jìn)行重組hITF的臨床前研究奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

人腸三葉因子；真核表達(dá)載體；CHO/dhfr-細(xì)胞

人腸三葉因子（human intestinal trefoil factor，hITF）屬于三葉因子家族中的一員，由59個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其中含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸序列，形成3對(duì)二硫鍵，從而產(chǎn)生特異而穩(wěn)定的三葉草結(jié)構(gòu)，這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，使其不受消化酶及pH值的影響，確保在胃腸道中發(fā)揮作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)［1-3］證實(shí)，hITF是一種重要的胃腸黏膜保護(hù)因子，其作用可能是通過與黏液糖蛋白形成穩(wěn)定的凝膠層復(fù)合物，保證了腸道屏障的完整性。目前多采用基因重組的方法獲得hITF。國(guó)內(nèi)報(bào)道［4］在大腸桿菌中表達(dá)出重組hITF，表達(dá)量為3～4 mg/L，但缺乏必要的折疊、修飾等后期加工，蛋白活性大大降低。本研究通過構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO/ dhfr-細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步進(jìn)行重組hITF的臨床前研究奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌體及細(xì)胞系：真核表達(dá)載體pIRES/dhfr由復(fù)旦大學(xué)遺傳所陶建軍博士贈(zèng)送；hITF的克隆質(zhì)粒pSG5-hITF由法國(guó)Catherine Tomasetto教授贈(zèng)送；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；CHO/dhfr-細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑和限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶（NheI、EcoRI）、T4 DNA Ligase購(gòu)自美國(guó)NEB公司；DNA Marker DL2000購(gòu)自加拿大Fermentas公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；F12培養(yǎng)基及HT購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清及透析胎牛血清購(gòu)自?shī)W地利PAA公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；hITF ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊艾博科技有限公司；G418購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；其余化學(xué)藥品均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)pSG5-hITF質(zhì)粒的hITF基因序列比對(duì)NCBI上hITF序列，發(fā)現(xiàn)其前面信號(hào)肽少了32 bp，故用重疊延伸PCR法，共設(shè)計(jì)5條引物：Homo-TFF3-P1：CCG GCTAGCACCATGAAGCGAGTCCTGAG CTGC（下劃線部分為NheI酶切位點(diǎn)）；Primer1：GAG CTGCGTCCCGGAGCCCACGGTGGTCATGGCTGC；Primer2：ATGAAGCGAGTCCTGAGCTGCGTCCCGGAGCC；Primer3：CAGAATGCACCTTCTGAG；Homo-TFF3-P2：CTAGAATTCTC AATGGTGATGGTGATGATG GAAGGTGCATTCTGCTTCCT（下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)，方框部分為6組氨酸標(biāo)簽）。

上游引物加入NheI酶切位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，下游引物加入EcoRI酶切位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，同時(shí)下游引物還引入6組氨酸標(biāo)簽以便于后期的檢測(cè)、純化。上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2目的片段的擴(kuò)增：第一輪PCR：用Primer1和Primer3作為一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，94 ℃預(yù)變性5 min，后94 ℃、57 ℃、72 ℃各30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后切膠，用QIAquick gen extraction kit進(jìn)行目的片段回收。第二輪PCR：以第一輪PCR的回收產(chǎn)物為模板，用Primer2和Primer3作為一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增（反應(yīng)體系同上述），擴(kuò)增產(chǎn)物電泳回收（同上述）。第三輪PCR：以第二輪PCR回收產(chǎn)物為模板，用Homo-TFF3-P1和Homo-TFF3-P2作為一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增（反應(yīng)體系同上述），擴(kuò)增產(chǎn)物電泳回收（同上述）。

1.2.3重組真核表達(dá)栽體pIRES/hITF/dhfr的構(gòu)建：以pIRES/dhfr為真核表達(dá)載體，將載體及目的基因片段均用NheI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別經(jīng)l.0%和1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收后，用T4 DNA Ligase連接目的片段和線性空載體質(zhì)粒。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，在含有Amp抗性的LB平板上涂板。第2天挑取單克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRI、NheI雙酶切鑒定。將酶切鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pIRES/hITF/dhfr送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，以確定插入片段的核苷酸序列和閱讀框架的正確性。

1.2.4轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞：CHO/dhfr-細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的F12培養(yǎng)液中，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。CHO/dhfr-細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h以每孔6×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)于6孔板。24 h后，細(xì)胞覆蓋孔底大致致密。以4 μg/孔的量進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，同時(shí)設(shè)空載體質(zhì)粒組和空白對(duì)照組，按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作。

1.2.5陽(yáng)性細(xì)胞克隆的篩選：轉(zhuǎn)染后48 h，細(xì)胞以1:10密度傳代，并在700 μg/mL G418的F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每2～3 d更換相同培養(yǎng)液并觀察陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)情況。1周左右空白對(duì)照組細(xì)胞脫落死亡，將轉(zhuǎn)染組長(zhǎng)出的抗性細(xì)胞群用胰酶消化后轉(zhuǎn)至新的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，用300 μg/mL G418濃度維持，直到細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)hITF轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)：收集CHO/ dhfr-空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染目的基因的CHO/ dhfr-細(xì)胞，按Trizol試劑說明書分別提取總RNA，取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄10 μL系中加入總RNA 1 μL隨機(jī)引物0.5 μL，10×RT Buffer 1 μL，dNTP （10 mmol/L）1 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，MgCl22 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL，混勻，30 ℃ 10 min，57 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min終止反應(yīng)。以β-actin（464 bp）為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)。在40 μL反應(yīng)體系中加入cDNA模板5 μL，5×PCR緩沖液10 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.25 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至45 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（30個(gè)循環(huán)）；72 ℃繼續(xù)延伸5 min。取等體積RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并照相。

1.2.7 分泌型融合蛋白的雙抗體夾心ELISA鑒定：在篩選出陽(yáng)性克隆后，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，取細(xì)胞上清液于無菌的離心管中，2 500 r/min離心20 min，取上清液，嚴(yán)格按照hITF的ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1目的基因片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過三輪PCR，最終在300 bp左右處可見特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期相符（見圖1）。

圖1　SOE-PCR法擴(kuò)增展hITF基因電泳圖

2.2重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES/hITF/dhfr的構(gòu)建及鑒定 分別將真核表達(dá)載體pIRES/dhfr和hITF基因雙酶切，回收純化目的片段，在連接酶作用下連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后挑選轉(zhuǎn)化克隆的數(shù)個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，小量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切，電泳顯示重組質(zhì)?？汕谐?個(gè)條帶，其中有一條帶在300 bp左右，提示重組成功（見圖2）。2.3 測(cè)序結(jié)果 序列測(cè)序結(jié)果表明，目的基因與GenBank中登錄的hITF cDNA的序列（NM_003226）完全一致，見圖3。

圖2　重組質(zhì)粒pIRES/hITF/dhfr的EcoRI和NheI雙酶切產(chǎn)物電泳圖

圖3　重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES/hITF/dhfr測(cè)序部分結(jié)果

2.4轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后48 h，細(xì)胞以1:10密度傳代，并在培養(yǎng)基中加入G418篩選，轉(zhuǎn)染了pIRES載體的細(xì)胞因?yàn)榫哂衝eo抗性而存活下來，不斷增殖成為細(xì)胞抗性克隆，第14～16天，6孔板內(nèi)剩下約6～8個(gè)細(xì)胞集落；正常對(duì)照組細(xì)胞由于沒有neo抗性，故在含有G418的培養(yǎng)基中將不能存活，并在培養(yǎng)基中可見大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎屑，1周左右死亡、脫落。

2.5RT-PCR檢測(cè)hITF在CHO/dhfr-細(xì)胞中的整合與轉(zhuǎn)錄 提取重組質(zhì)粒組及空載體質(zhì)粒組篩選后的CHO/dhfr-細(xì)胞總RNA。重組質(zhì)粒組擴(kuò)增出一條300 bp左右的特異性hITF基因產(chǎn)物，而空載體質(zhì)粒組則未見相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，提示hITF基因成功整合入CHO/dhfr-細(xì)胞的基因組并可轉(zhuǎn)錄為mRNA，RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖4　轉(zhuǎn)染后RT-PCR檢測(cè)hITF基因在CHO/dhf-細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

2.6雙抗體夾心法ELISA結(jié)果 加入轉(zhuǎn)染了pIRES/ hITF/dhfr的CHO/dhfr-細(xì)胞上清液的孔在加入顯色劑孵育15 min后呈現(xiàn)了明顯的肉眼可見的藍(lán)色，而空白對(duì)照孔、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清孔和空載體質(zhì)粒組孔均未出現(xiàn)顯色反應(yīng)，說明這些標(biāo)本中不含有hITF蛋白，而轉(zhuǎn)染了hITF基因的CHO/dhfr-細(xì)胞能分泌蛋白。標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本在酶標(biāo)儀上測(cè)其OD450值，用curve expert 1.3軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD450值及標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制的hITF蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（r=0.9999）。用該軟件計(jì)算出轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒組的CHO/dhfr-細(xì)胞上清液標(biāo)本中hITF蛋白的濃度0.163 mg/L。

3　討論

hITF屬三葉肽家族，生理狀況下存在于哺乳動(dòng)物的多種組織中，但主要分布在腸道，整個(gè)腸道中以十二指腸含量最高，空回腸次之，此外，在唾液腺、下頜下腺、胰腺及宮頸黏液中也有少量表達(dá)［5-7］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［2-3］，hITF在維持腸道黏膜完整性、促進(jìn)腸黏膜損傷后的重建和修復(fù)中有著獨(dú)特的重要作用，阻止多種蛋白酶以及機(jī)械應(yīng)力改變等因素造成的腸黏膜損傷。hITF還與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可作為多種腫瘤的生物標(biāo)志物，應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療與預(yù)后評(píng)價(jià)等［8-14］。

目前，重組hITF主要為來自大腸桿菌或酵母菌2種細(xì)胞系的表達(dá)產(chǎn)物。有報(bào)道［4］用大腸桿菌表達(dá)hITF，但由于大腸桿菌表達(dá)的重組hITF缺乏必要的折疊、修飾等后期加工，因此該蛋白活性大大降低。Thim等［15］報(bào)道的表達(dá)體系由于采用了釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶的啟動(dòng)子和終止子，使得表達(dá)的融合蛋白能直接分泌到細(xì)胞外，其效率達(dá)100 mg/L，但該系統(tǒng)仍具有一定的局限性［16］，如表達(dá)的蛋白過度糖基化等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系翻譯后的加工修飾體系更完善，產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，因此我們選擇了CHO細(xì)胞表達(dá)體系。目前研究［17］結(jié)果顯示，決定重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)水平的因素是多方面的，包括目的基因在基因組上的拷貝數(shù)，目的基因在基因組的整合位點(diǎn)以及啟動(dòng)子強(qiáng)度等。其中，實(shí)現(xiàn)目的基因在細(xì)胞基因組中轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的整合是一個(gè)關(guān)鍵因素。弱化篩選基因，從而提高目的基因在熱點(diǎn)整合克隆的概率是一種思路。本研究所采用的載體為pIRES，在上游強(qiáng)啟動(dòng)子CMV的控制下，該序列可和與之相連接的基因同時(shí)轉(zhuǎn)錄，翻譯出不同的蛋白。位于IRES序列兩側(cè)的2個(gè)多克隆位點(diǎn)可以高效表達(dá)2個(gè)基因。一般來說，IRES序列后面的基因的表達(dá)量要低10倍左右。因此，我們?cè)诙嗫寺∥稽c(diǎn)A插入目的基因，多克隆位點(diǎn)B插入二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，dhfr）基因，弱化了篩選基因，從而實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的目的。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRES/ hITF/dhfr，采用PCR、酶切及DNA序列測(cè)定等多種方法驗(yàn)證，保證了結(jié)果的可信性。轉(zhuǎn)染到CHO/dhfr-細(xì)胞中，通過G418篩選和基因組DNA的PCR分析等方法，成功建立了一個(gè)在基因組DNA中穩(wěn)定整合有pIRES/hITF/dhfr的CHO細(xì)胞克隆。然后將該細(xì)胞克隆的細(xì)胞擴(kuò)增，提取總RNA，RT-PCR鑒定hITF基因的mRNA水平。為了方便蛋白大量生產(chǎn)以及后期純化，實(shí)驗(yàn)者通常會(huì)選擇在載體或者目的片段上添加信號(hào)肽序列，這樣可以增強(qiáng)蛋白的胞外分泌能力，本實(shí)驗(yàn)選擇在目的片段上添加信號(hào)肽序列，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA方法檢測(cè)到有hITF蛋白的表達(dá)。CHO/dhfr-細(xì)胞自身缺失dhfr，所以必須在添加了次黃嘌呤、胸腺嘧啶的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過目的基因與dhfr基因共轉(zhuǎn)染，不僅可在不含HT的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，更為重要的是由于dhfr可被葉酸類似物MTX所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，dfhr基因可自發(fā)在染色體上擴(kuò)增，從而產(chǎn)生更多的dhfr來維持細(xì)胞的正常代謝。當(dāng)其擴(kuò)增時(shí)，可以連帶它兩側(cè)幾十至上千kb的序列一起擴(kuò)增，也就實(shí)現(xiàn)了目的基因劑量的擴(kuò)增，從而極大地提高了目的基因的表達(dá)產(chǎn)量［18］。Hwang等［19］用目的基因轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞，經(jīng)過3個(gè)濃度MTX加壓后，目的蛋白產(chǎn)量比加壓之前增加了57倍。本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間倉(cāng)促，未進(jìn)行MTX加壓實(shí)驗(yàn)，下一步實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行加壓，蛋白產(chǎn)量相信會(huì)有所提高。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了帶有hITF基因的重組真核表達(dá)載體pIRES/hITF/dhfr，高效轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到hITF蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行重組hITF的臨床前研究奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Construction of recombinant eukaryotic expression vector of human intestinal trefoil factor and its expression in CHO/dhfr- cells

ZHU Ronghe1，CHEN Huiyao2，ZHUANG Qiang2，JIANG Songfu2. 1.Department of Pediatric，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 2.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Objective： To construct eukaryotic expressing vector of human intestinal trefoil factor and express hITF protein in dihydrofolate reductase-defcient Chineses hamster ovary cells （CHO/dhfr-）. Methods： The full length cDNA fragment was amplifed by overlap extension PCR，then inserted into eukaryotic expression vector pIRES/dhfr. The recombinant vector was transfected into CHO/dhfr- cells by LipofectamineTM2000. The stable transfected CHO/dhfr- cell line was then established by screening cultures with G418. RT-PCR and ELISA were used to detect the expression of the protein. Results： The eukaryotic expression vector was constructed successfully，stable transfected CHO cell line was established，and hITF protein was expressed successfully. Conclusion： The recombinant plasmid pIRES/hITF/dhfr is successfully constructed and it expresses the protein in the supernatant of the CHO/dhfr- cells，which is the basis for pre-clinical study.

human intestinal trefoil factor； eukaryotic expressing vector； CHO/dhfr- cells

Q786

A DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.003

2015-11-24

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y207422）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金（2007A137）；溫州市科技局合作項(xiàng)目（H20090010）。

朱融和（1985-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

江松福，教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：jiangsf@188.com。