杜傳榮，林發(fā)全，逯東偉，陳丹丹，樊希望，林翠梧,4*

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧　530004；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧　530021；3.南寧市化工研究設(shè)計院，廣西 南寧　530022;　4.廣西高校應(yīng)用化學(xué)技術(shù)與資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧　530004)

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香草酸酰胺衍生物的制備及其止血活性的動力學(xué)法研究

杜傳榮1，林發(fā)全2，逯東偉1，陳丹丹1，樊希望3，林翠梧1,4*

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530021；3.南寧市化工研究設(shè)計院，廣西 南寧530022;4.廣西高校應(yīng)用化學(xué)技術(shù)與資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530004)

以香草酸為母體，分別與6-氨基己酸(EACA)、止血芳酸(AMBA)和止血環(huán)酸(AMCA)反應(yīng)，合成3種未見文獻(xiàn)報道的香草酸酰胺衍生物，并采用IR、ESI-MS、1H NMR和13C NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。以傳統(tǒng)方法、熒光動力學(xué)法和紫外動力學(xué)法測定其對血漿復(fù)鈣時間(PRT)的影響。為了研究衍生物在血液中的穩(wěn)定性，在模擬生理?xiàng)l件下，運(yùn)用熒光光譜、紫外光譜及分子對接技術(shù)研究了它分別與人血清白蛋白(HSA)的結(jié)合。結(jié)果表明，3種衍生物在一定濃度范圍內(nèi)都可以有效縮短PRT，具有顯著的止血活性。新的動力學(xué)測定方法，不僅有效避免了傳統(tǒng)方法引入的人為誤差，重現(xiàn)性良好，而且判斷標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)，并可以獲得更多血漿凝結(jié)過程中的信息。3種衍生物均主要通過氫鍵和范德華力與HSA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，表明它可通過HSA在血液中傳遞并運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)部位而發(fā)生藥理作用。

香草酸；酰胺衍生物；止血；人血清白蛋白(HSA)；光譜法

*Corresponding Author,E-mail:cuiwulin114@163.com

1　引　　言

許多疾病和意外傷害往往引發(fā)危重出血，如惡性腫瘤、病理產(chǎn)科、外傷、外科手術(shù)及彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等。造成許多患者早期死亡的主要原因之一恰恰就是無法有效控制危重出血。因此，快速、安全、有效地止血不僅可以為搶救生命贏取寶貴時間，還可以大大降低危重出血死亡率。這使得止血藥成為搶救生命必不可少的關(guān)鍵藥物之一[1-3]。臨床常用的止血藥有6-氨基己酸、止血芳酸、止血環(huán)酸，但存在腹瀉、惡心及嘔吐、瞳部不適、頭痛、頭暈等副作用。因此，通過體外藥理活性實(shí)驗(yàn)篩選更加有效且毒副作用更小的潛在止血藥，越來越受到人們的關(guān)注和重視，并成為探索及開發(fā)新型止血藥的研究趨勢[4-6]。

香草酸又名香莢蘭酸，是胡黃連、蜂膠、高麗參等眾多傳統(tǒng)中藥材中的有效成分之一。國內(nèi)外對香草酸及其衍生物的生理活性研究報道較少，主要集中于抗菌消炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、化感作用、調(diào)節(jié)神經(jīng)等方面[7-11]，而有關(guān)促凝血活性鮮有報道?；诨钚辕B加、減少不良反應(yīng)兩方面考慮，以香草酸為母體，分別與6-氨基己酸、止血芳酸和止血環(huán)酸反應(yīng)，合成了3種未見報道的香草酸酰胺衍生物。采用傳統(tǒng)方法、熒光動力學(xué)法和紫外動力學(xué)法測定并確定其能有效縮短血漿復(fù)鈣時間(PRT)，具有顯著的止血活性。新動力學(xué)測定方法，不僅有效避免了傳統(tǒng)方法引入的人為誤差，重現(xiàn)性良好，而且判斷標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)，還能獲得更多血漿凝結(jié)過程中的信息。另外，藥物進(jìn)入人體后，是通過血液進(jìn)行運(yùn)輸，而大多情況下藥物會先與血漿中的蛋白結(jié)合。人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最大的蛋白，具有結(jié)合和運(yùn)輸藥物小分子、氨基酸及脂肪酸等很多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的作用。藥物與HSA的結(jié)合，不僅能夠增加其在血液中的溶解度，還能避免被氧化及延長治療半衰期[12-13]。為了研究衍生物在血液中的穩(wěn)定性，在模擬生理?xiàng)l件下，本文運(yùn)用光譜法及分子對接技術(shù)研究了其與HSA的相互作用。結(jié)果表明，3種衍生物均可與HSA形成穩(wěn)定復(fù)合物，即都可通過HSA在血液中傳遞及運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)部位而發(fā)生藥理作用。本研究為香草酸酰胺衍生物在人體內(nèi)的運(yùn)輸、作用機(jī)理及臨床促凝藥物的篩選提供了可靠的理論信息和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2　實(shí)　　驗(yàn)

2.1儀器與試劑

儀器：Agilent Cary 60 UV-Vis紫外-可見分光光度計(有恒溫裝置，美國Agilent Technologies公司)；Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer熒光分光光度計(有恒溫裝置，美國Agilent Technologies公司)；Bruker Tensor 27紅外光譜儀(德國Bruker公司)；Shimadzu LCMS-8040液質(zhì)聯(lián)用儀(日本Shimadzu公司)；Bruker Avance-600 NMR Spectrometer 核磁共振儀(600 MHz，德國Bruker)；Boetius顯微熔點(diǎn)測定儀(德國Boetius公司)；Milli-Q Advantage A10(美國Millipore公司)。

試劑：人血清白蛋白(HSA，99%，美國Sigma公司)；pH=7.4的PBS緩沖液(粉劑，美國Sigma)；香草酸、6-氨基己酸、止血芳酸、止血環(huán)酸均購于珠海嘉信康醫(yī)藥科技有限公司(HPLC ≥ 95%)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

2.2衍生物的制備及結(jié)構(gòu)表征

2.2.1衍生物的制備

將香草酸40 mmol、乙酸酐40 mL、吡啶2 mL在120 ℃下回流反應(yīng)12 h。減壓旋蒸除去溶劑，加入大量冰水，并劇烈攪拌過夜，產(chǎn)生大量白色固體。靜置，抽濾，用水洗至濾液為中性，干燥，收率約為97%。取對乙?；悴菟?0 mmol、SOCl215 mL在85 ℃下回流反應(yīng)6 h。減壓旋蒸除去溶劑，冷卻后用5 mL的 THF溶解。將40 mmol 的6-氨基己酸(止血芳酸/止血環(huán)酸)溶于20 mL濃度為2 mol/L的NaOH溶液，在10～15 ℃下滴入對乙?；悴蒗Ｂ热芤?，反應(yīng)過程中維持反應(yīng)液pH=8～9，室溫反應(yīng)5 h后用HCl溶液調(diào)節(jié)pH=4～5，有白色固體(或粘稠狀物)析出，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得到塊狀或片狀晶體。合成路線如圖1所示。

圖13種衍生物的合成路線

Fig.1Synthetic route of the three derivatives

2.2.2衍生物的結(jié)構(gòu)表征

2.3傳統(tǒng)方法測定PRT

向內(nèi)徑8 mm的試管中分別加入0.1 mL血漿和0.1 mL樣品溶液，輕搖混勻，37 ℃恒溫5 min，加入0.1 mL CaCl2溶液，立即啟動秒表計時，每隔10 s傾斜試管一次，至混和液中出現(xiàn)大量彌漫的白色顆粒纖維蛋白絲，液面不動時，記為PRT。以生理鹽水為正常對照，AMBA為陽性對照。各組重復(fù)6次，取平均值。

2.4熒光動力學(xué)法測定PRT

向石英比色皿中加入0.1 mL血漿和0.1 mL樣品溶液，輕搖混勻，37 ℃恒溫5 min，加入0.1 mL CaCl2溶液，立即開啟熒光動力學(xué)測試，至熒光強(qiáng)度基本不隨時間變化為止。以生理鹽水為正常對照，AMBA為陽性對照。各組重復(fù)3次，取平均值。設(shè)置激發(fā)波長為299 nm，發(fā)射波長為346 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為5 nm，測試時間為500 s。

2.5紫外動力學(xué)法測定PRT

操作步驟與熒光動力學(xué)法相似。測試波長為411 nm，測試時間間隔為1 s，掃描時間為500 s。

2.6衍生物與HSA的相互作用

光譜測定：激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為5/2.5 nm，測定不同衍生物-HSA溶液的發(fā)射光譜(掃描范圍300～500 nm)、同步熒光光譜(Δλ=60 nm和Δλ=15 nm)。以PBS緩沖液為參比，測定各溶液的吸收光譜(掃描范圍200～500 nm)。

分子模擬：通過AutoDock 4.2將不同衍生物小分子對接到HSA中，拉馬克遺傳算法(LGA)計算結(jié)合模型，預(yù)測可能存在的構(gòu)象。分別計算了各衍生物可能存在的10種結(jié)合模型，以結(jié)合能最負(fù)的最佳。LigPlot+軟件[14]進(jìn)一步分析其微觀結(jié)合模型。

3　結(jié)果與討論

3.1傳統(tǒng)方法測定的PRT

(1)

由表1可知，與生理鹽水正常組比較，3種衍生物在0.062 5～0.25 mmol·L-1濃度范圍均能明顯縮短PRT，有顯著的止血活性。其中衍生物Ⅱ的止血活性最好，在0.031 25～0.125 mmol·L-1濃度范圍內(nèi)優(yōu)于陽性對照止血芳酸組。但受試藥物均在高濃度時止血活性下降，甚至PRT稍大于正常對照組。

表1　傳統(tǒng)方法不同衍生物的PRT(n=6)

注：與正常對照組比較，*p < 0.05，**p<0.01。

3.2熒光動力學(xué)法測定的PRT

采用熒光動力學(xué)測試方法，測試了血漿從加入CaCl2開始至完全凝結(jié)這一過程中熒光強(qiáng)度的變化曲線，如圖2所示。結(jié)果顯示，隨衍生物濃度的增大，血漿的熒光明顯變?nèi)酰砻餮苌飳ρ獫{有猝滅作用。熒光動力學(xué)曲線呈Z字形，即加入CaCl2一段時間后，血漿熒光強(qiáng)度先是不斷降低，最后基本保持不變。這可能是由于隨著血漿內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能的恢復(fù)，血漿逐漸開始凝結(jié)，血漿形態(tài)逐漸從流動液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀，這種轉(zhuǎn)變不僅導(dǎo)致有效到達(dá)血漿中發(fā)光官能團(tuán)的激發(fā)光強(qiáng)度降低，而且發(fā)射光也因血漿的凝結(jié)而產(chǎn)生更大的內(nèi)濾效應(yīng)。將熒光動力學(xué)曲線求一階導(dǎo)數(shù)，獲得對應(yīng)的一階導(dǎo)數(shù)曲線。一階導(dǎo)數(shù)曲線反映出血漿熒光強(qiáng)度減弱的速率，將峰值對應(yīng)的時間即熒光強(qiáng)度降低最快的點(diǎn)定為血漿復(fù)鈣凝血時間。在此時間點(diǎn)，肉眼觀察血漿中已產(chǎn)生大量白色顆粒纖維蛋白絲，并且液面不動，血漿基本完全凝結(jié)。這表明該判斷標(biāo)準(zhǔn)與傳統(tǒng)方法一致。不同衍生物的PRT縮短率見圖4。結(jié)果表明，衍生物在0.062 5～0.25 mmol·L-1濃度范圍均能明顯縮短PRT，且在0.125 mmol·L-1時促凝效果最好。但濃度繼續(xù)變大時止血效果反而下降，甚至PRT稍大于正常對照組。熒光動力學(xué)法與傳統(tǒng)方法測試PRT結(jié)果一致，且測試穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

圖2　不同衍生物作用下PRT熒光動力學(xué)曲線及其一階導(dǎo)數(shù)曲線

3.3紫外動力學(xué)法測定的PRT

采用紫外動力學(xué)法測試了血漿從加入CaCl2開始至完全凝結(jié)這一過程中紫外吸收強(qiáng)度隨時間的變化曲線，如圖3所示。結(jié)果顯示，紫外動力學(xué)曲線呈反Z字形，即加入CaCl2一段時間后，血漿吸收強(qiáng)度先是不斷升高，最后基本保持不變。這可能是由于隨著血漿的不斷凝結(jié)，呈膠狀后的血漿對光的反射增強(qiáng)，導(dǎo)致光的透過率降低。對紫外動力學(xué)曲線求一階導(dǎo)數(shù)，獲得一階導(dǎo)數(shù)曲線。一階導(dǎo)數(shù)曲線反映出血漿紫外透過率減弱的速率，將峰值對應(yīng)的時間即紫外透過率強(qiáng)度降低最快的點(diǎn)作為血漿復(fù)鈣凝血時間。在該時間點(diǎn)，肉眼觀察血漿中同樣已產(chǎn)生大量白色顆粒纖維蛋白絲，并且液面不動，血漿基本完全凝結(jié)。這表明該判斷標(biāo)準(zhǔn)與傳統(tǒng)方法一致。不同衍生物的PRT縮短率圖見圖4。結(jié)果表明，衍生物的加入，引起血漿的最終吸收強(qiáng)度變大。這可能是由于衍生物在血漿的凝結(jié)過程中促進(jìn)其產(chǎn)生更多的白色顆粒纖維蛋白絲，導(dǎo)致光透過率降低。衍生物在0.062 5～0.5 mmol·L-1濃度范圍均能明顯縮短PRT，且濃度為0.125 mmol·L-1時促凝效果最好，表現(xiàn)出顯著的止血活性。但濃度繼續(xù)變大時止血效果反而下降，甚至PRT稍大于正常對照組。紫外動力學(xué)法與熒光動力學(xué)法以及傳統(tǒng)方法測試PRT結(jié)果一致，且測試穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

圖3　不同衍生物作用下的PRT紫外動力學(xué)曲線及其一階導(dǎo)數(shù)曲線

圖4　不同方法的PRT縮短率

3.43種方法測試PRT的比較

傳統(tǒng)方法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，簡便易行，但存在著不可避免的缺陷：

(1)肉眼判斷血漿凝結(jié)過程，不同測試者的認(rèn)定差異及視力差別無法避免，即便是同一測試者，也無法精確辨別血漿凝結(jié)80%～100%的程度，必然引起不同程度的誤差；

(2)測試過程中需要將試管移出水槽觀察，試管內(nèi)血漿無法保證持續(xù)恒溫，影響血漿的凝結(jié)；

(3)測試過程中每隔10 s傾斜一次試管，判斷是否凝結(jié)，此過程中會產(chǎn)生不同程度的震動，導(dǎo)致血漿凝結(jié)延緩，且各試管取放次數(shù)、震動強(qiáng)弱不一定相同，引入很大人為誤差，嚴(yán)重影響測定結(jié)果的真實(shí)性；

(4)每隔10 s觀測一次，有可能自上一次觀察后的3，4，5 s時血漿產(chǎn)生凝結(jié)，會導(dǎo)致判斷延誤；

(5)為了減少上述誤差，測試時往往需要多次重復(fù)測量，使得工作強(qiáng)度加大，且浪費(fèi)血漿和試劑。

熒光/紫外動力學(xué)法需使用熒光/紫外-可見分光光度計。具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)通過恒溫裝置，可以有效避免傳統(tǒng)方法引入的溫度因素誤差；

(2)不需要反復(fù)取出觀察，避免了震動對血漿凝結(jié)過程的干擾；

(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，實(shí)驗(yàn)證明，光強(qiáng)度變化最快的時間點(diǎn)，肉眼觀察血漿中已產(chǎn)生大量白色絮狀物質(zhì)，傾斜液面不會流動，血漿凝結(jié)完全，這一判定標(biāo)準(zhǔn)與傳統(tǒng)方法吻合；

(4)根據(jù)動力學(xué)曲線可獲得更多血漿凝結(jié)過程中的信息，如凝結(jié)速率；

(5)重現(xiàn)性良好，且節(jié)約血漿和試劑。

但熒光動力學(xué)存在局限性：若藥物對血漿的熒光產(chǎn)生極強(qiáng)的猝滅作用，就無法測試其熒光強(qiáng)度隨時間變化情況，即無法測試該藥物對PRT的影響。紫外動力學(xué)雖可以有效地避免熒光動力學(xué)存在的猝滅作用，但儀器精密度普遍低于熒光。

3.5衍生物與HSA的相互作用

3.5.1不同衍生物-HSA體系的熒光發(fā)射光譜

由圖5(a)可見，HSA內(nèi)源性熒光隨衍生物Ⅱ濃度的增大，發(fā)生明顯猝滅，峰形不變(衍生物Ⅰ/Ⅲ-HSA體系圖形與之類似)。最大熒光發(fā)射峰對應(yīng)波長出現(xiàn)略微紅移現(xiàn)象(Ⅰ-HSA：由353 nm移至356 nm；Ⅱ-HSA：由353 nm移至359 nm；Ⅲ-HSA：由353 nm移至358 nm)。這表明3種衍生物與HSA的結(jié)合導(dǎo)致組成色氨酸殘基(Trp)周圍疏水腔的肽鏈呈現(xiàn)部分伸展，極性增大，疏水性減小，改變了HSA二級空間結(jié)構(gòu)[16]。

3.5.2不同衍生物-HSA的猝滅機(jī)理

不同溫度下衍生物Ⅱ-HSA體系Stern-Volmer曲線見圖5(b)，可以看出各曲線的線性良好(衍生物Ⅰ/Ⅲ-HSA體系圖形與之類似)。表2是不同溫度下各體系的猝滅常數(shù)，由表可知，隨著溫度的升高，Ksv變小，Kq值均顯著大于2.0×1010L·mol-1·s-1[17-18]。這表明各衍生物均與HSA結(jié)合形成新的非共價復(fù)合物，且其穩(wěn)定性隨著溫度升高而降低，是靜態(tài)猝滅。

a～j:c(HSA)=1.0×10-5mol·L-1; c(Ⅱ)=(0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)×10-5mol·L-1; k:c (Ⅱ) = 1.0×10-5mol·L-1

圖5　(a) 衍生物Ⅱ與HSA相互作用的熒光光譜；(b) Stern-Volmer曲線；(c) lg[(F0-F)/F]vs.lg[Q]。

3.5.3衍生物-HSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

圖5(c)是衍生物Ⅱ與HSA結(jié)合的lg[(F0- F)/F]對lg[Q]的雙對數(shù)曲線，可以看出線性關(guān)系良好(衍生物I/Ⅲ-HSA體系圖形與之類似)。不同衍生物與HSA結(jié)合的KA、n見表3。所有n值均約為1，表明不同衍生物分別與HSA結(jié)合時都只有1個結(jié)合位點(diǎn)。溫度升高，KA值減小，表明復(fù)合物穩(wěn)定性降低，為靜態(tài)猝滅[19-20]。

表3　HSA與不同衍生物結(jié)合的結(jié)合參數(shù)

3.5.4不同衍生物-HSA的能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離

蛋白質(zhì)大分子與小分子相互結(jié)合的結(jié)合距離(r)與能量轉(zhuǎn)移效率(E)之間的關(guān)系用F?ster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算[21-22]。不同衍生物紫外吸收光譜與HSA熒光光譜的重疊圖見圖6，J、E、r值見表4。不同衍生物-HSA的r<7 nm，并滿足0.5R0R0，這表示非輻能量轉(zhuǎn)移引起HSA熒光猝滅概率小于靜態(tài)猝滅[23-24]。

T= 298 K,c(HSA)=c(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ)=1.0×10-5 mol·L-1

圖6HSA熒光發(fā)射光譜(a)與不同衍生物紫外吸收光譜(b)重疊圖

Fig.6Overlap of fluorescence emission spectrum of HSA (a) and absorption spectra of different derivatives (b)

表4　HSA與不同衍生物的結(jié)合距離參數(shù)

3.5.5不同衍生物-HSA體系的相互作用力類型

根據(jù)van’t Hoff定律[21,25]，兩物質(zhì)間結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)ΔG、ΔH、ΔS值見表5。不同衍生物-HSA體系的ΔG<0，ΔH<0，ΔS<0，表明兩者間的結(jié)合均是焓驅(qū)動的自發(fā)過程，范德華力和氫鍵作用力是維持其結(jié)合的主要作用力類型[25-26]。

表5　HSA與不同衍生物結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

3.5.6不同衍生物對HSA構(gòu)象的影響

衍生物Ⅱ與HSA結(jié)合的同步熒光光譜見圖7(衍生物Ⅰ/Ⅲ-HSA體系圖形與之類似)。隨著衍生物濃度的升高，HSA內(nèi)源性熒光強(qiáng)度明顯降低。Δλ=15 nm時，最大發(fā)射波長基本保持不變，表明Tyr周圍環(huán)境基本不變；而Δλ=60 nm時，最大發(fā)射波長出現(xiàn)了明顯紅移，表明Trp周圍環(huán)境極性變大，疏水性減小[26-27]。這是由于衍生物與HSA結(jié)合形成復(fù)合物后，HSA二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生明顯變化，內(nèi)部肽鏈伸展程度出現(xiàn)一定程度的增加，疏水腔內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度瓦解，導(dǎo)致Trp基本全部裸露于介質(zhì)的親水環(huán)境中[28-29]。

a～j:c(HSA) = 1.0×10-5mol·L-1,c(Ⅱ)=0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0 ×10-5mol·L-1; k:c(Ⅱ) = 1.0×10-5mol·L-1

圖7衍生物Ⅱ與HSA結(jié)合的同步熒光光譜

Fig.7Synchronous fluorescence spectra of derivative Ⅱ-HSA

3.5.7分子模擬研究衍生物與HSA的相互作用

3種衍生物分別與HSA的分子對接模型見圖8，結(jié)合時均主要處于其亞結(jié)構(gòu)域ⅡA口袋。衍生物Ⅰ與Lys195、Trp214、Val344、Arg348、Glu450、Asp451、Leu481、Val482、Arg484、Arg485形成氫鍵，周圍還存在著疏水作用殘基Val343、Ser454、Asn483、Pro486。衍生物Ⅱ與Trp214、Val343、Leu345、Arg348、Met446、Leu457、Asn458、Ser480、Leu481、Arg484、Arg485形成氫鍵，周圍還存在著疏水作用殘基Trp214、Val344、Glu450、Ser454。衍生物Ⅲ與Lys195、Trp214、Arg218、Arg222、Glu450、Leu453、Ser454、Leu457、Asn458、Arg484形成氫鍵，周圍還存在著疏水作用殘基Leu198、Val343、Val344、Asp451、Leu481、Arg485。結(jié)果表明，HSA分別與3種衍生物的結(jié)合都影響了分子內(nèi)部Trp214周圍的微環(huán)境，導(dǎo)致內(nèi)源性熒光出現(xiàn)猝滅現(xiàn)象。衍生物與HSA結(jié)合的主要作用力是范德華力和氫鍵，兼有部分疏水作用。對接得到不同衍生物與HSA結(jié)合的-G分別為-21.52 kJ·mol-1(Ⅰ-HSA)，-26.79 kJ·mol-1(Ⅱ-HSA)和-25.49 kJ·mol-1(Ⅲ-HSA)，計算值與實(shí)驗(yàn)值存在略微差異，可能是因?yàn)閷訒r以HSA晶體形態(tài)進(jìn)行，而實(shí)驗(yàn)時兩者均處于溶液環(huán)境[14,30]。

圖8　HSA與不同衍生物結(jié)合的分子對接圖

4　結(jié)　　論

血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果表明，與正常對照組比較，3種衍生物在一定濃度范圍內(nèi)可明顯縮短PRT，表現(xiàn)出良好的止血活性。其中衍生物Ⅱ促凝效果最佳，在一定濃度范圍內(nèi)優(yōu)于陽性對照止血芳酸組。熒光動力學(xué)法和紫外動力學(xué)法不僅可以有效避免傳統(tǒng)方法引入的人為誤差，而且重現(xiàn)性良好，判斷標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)，同時可以獲得更多血漿凝結(jié)過程的信息。光譜實(shí)驗(yàn)和分子對接結(jié)果表明，3種衍生物均可以與HSA相互結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，作用力類型均主要是范德華力和氫鍵。3種香草酸酰胺衍生物均可以HSA為載體，通過血液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)作用部位發(fā)生藥理作用，有望進(jìn)入臨床促凝藥物的篩選范圍。

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杜傳榮(1988-)，女，山東滕州人，博士研究生，2010年于廣西大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事天然藥物化學(xué)方面的研究。

E-mail：duchuanrong123@163.com

林翠梧(1958-)，女，廣西北流人，教授，博士生導(dǎo)師，2000年于中山大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事天然藥物化學(xué)方面的研究。

E-mail：cuiwulin114@163.com

Synthesis of Vanillylamide Derivatives and Their Hemostatic Activity in Vitro by Kinetics Methods

DU Chuan-rong1,LIN Fa-quan2,LU Dong-wei1,CHEN Dan-dan1,FAN Xi-wang3,LIN Cui-wu1,4*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;3.Nanning Chemical Industry Research & Design Institute,Nanning 530022,China;4.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Applied Chemistry Technology and Resource Development,Nanning 530004,China)

Three novel amide derivatives were designed and prepared by the reaction of vanillic acid with 6-aminocaproic acid (EACA),p-aminomethylbeozoic acid (AMBA) or tranexamic acid (AMCA),respectively.The structures were identified by IR,ESI-MS,1H NMR and13C NMR.In order to study their hemostatic activity in vitro,the plasma recalcification time (PRT) was determined by traditional method,fluorescence kinetics method and UV kinetics method,respectively.In order to study the stability of derivatives in blood,the interaction between derivatives and human serum albumin (HSA) was investigated under imitated physiological condition by fluorescence spectroscopy,UV-visible absorption spectroscopy and molecular docking,respectively.The results stated clearly that derivatives could reduce PRT significantly and exhibit obvious procoagulant effect in vitro.Moreover,in some concentrations,the hemostatic activity of derivative Ⅱ was better than AMBA.The results obtained by three different methods were in correspondence.New kinetics methods not only avoided artificial error effectually but also had good repeatability.In addition,more reasonable and credible information could be obtained in the process of serum agglutination.On the other hand,the spectra experiments showed that three derivatives could all form stable complexes with HSA respectively.The binding types between derivatives and HSA were all van der Waals force and hydrogen bonds.The results were accordant with molecular docking.It indicates that all the derivatives can be transferred and delivered by HSA to play pharmacological effects at corresponding site.Consequently,there is a strong possibility that the three vanillylamide derivatives can be applied to practice.

vanillic acid; amide derivatives; hemostasia; human serum albumin (HSA); spectroscopic methodology

1000-7032(2016)04-0487-11

2015-11-26；

2016-01-12

廣西研究生教育創(chuàng)新計劃(YCBZ2013011)；廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013GXNSFDA019005)；國家自然科學(xué)基金(21362001)資助項(xiàng)目

O625.5

A

10.3788/fgxb20163704.0487