喬健敏， 張家超， 鄭 藝， 侯強(qiáng)川， 黃衛(wèi)強(qiáng)， 霍冬雪， 郭 壯， 張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

無(wú)錫城鄉(xiāng)年輕居民腸道菌群多樣性研究

喬健敏， 張家超， 鄭 藝， 侯強(qiáng)川， 黃衛(wèi)強(qiáng)， 霍冬雪， 郭 壯， 張和平*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

采用PCR和DGGE相結(jié)合的技術(shù)，研究了生活于無(wú)錫城市和鄉(xiāng)村的青年志愿者腸道菌群的多樣性。基于DGGE指紋圖譜，使用聚類和PCA分析對(duì)志愿者腸道微生物相似性進(jìn)行分析，使用Shannon-Weine多樣性指數(shù)（H）、豐度（S）和均勻度（EH）對(duì)志愿者腸道微生物多樣性進(jìn)行分析，對(duì)圖譜中具有代表性的共性和特異性條帶進(jìn)行膠回收和測(cè)序以分析志愿者腸道微生物組成；基于PCR技術(shù)在種水平上對(duì)城鄉(xiāng)志愿者腸道內(nèi)乳桿菌屬 （Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）多樣性進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示，無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民間腸道微生物群落結(jié)構(gòu)存在分開(kāi)趨勢(shì)，相似性小于城市或鄉(xiāng)村居民內(nèi)部；多樣性方面差異不顯著；不動(dòng)桿菌屬、雙歧桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌屬為城鄉(xiāng)青年居民腸道內(nèi)的共有菌屬；乳桿菌屬Lactobacillus（L.）和雙歧桿菌屬Bifidobacterium（B.）各類菌群在城鄉(xiāng)居民腸道內(nèi)分布差異不顯著，其中L.plantarum，L.casei，L.salivarius和L.acidophilus以及B.longum，B.breve，B.animalis 和B.adolescentis分別為無(wú)錫青年居民腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)乳桿菌和雙歧桿菌。綜上分析，初步揭示了無(wú)錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著。

無(wú)錫城鄉(xiāng)年輕居民；微生物多樣性；PCR技術(shù)；DGGE技術(shù)

17世紀(jì)50年代，在微生物學(xué)之父列文虎克借助自己發(fā)明的顯微鏡開(kāi)始研究微生物的同時(shí)，關(guān)于人類腸道微生物的研究也隨之開(kāi)始［1-2］。據(jù)報(bào)道，健康成年人腸道微生物的總數(shù)達(dá)1014個(gè)，10倍于人體細(xì)胞，其微生物基因數(shù)量約為300萬(wàn)個(gè)，約為人類基因組基因數(shù)量的100倍。因此，研究者們將人體腸道微生物基因組稱為人體的第二基因組［3］。這些微生物與宿主共進(jìn)化，直接參與人體的能量代謝和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，對(duì)于人的健康扮演著重要的角色［4］。

隨著科學(xué)家使用不同的技術(shù)手段對(duì)不同年齡、不同國(guó)籍、不同遺傳背景和生活習(xí)慣的人群腸道微生物的研究，發(fā)現(xiàn)人體的腸道微生物多樣性在宿主2歲后開(kāi)始趨于穩(wěn)定并成人化，此后，隨著宿主進(jìn)入成人期，生活方式和飲食習(xí)慣成為影響宿主腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的更重要的因素［4-5］。早于1974年，F(xiàn)inegold［6］等通過(guò)對(duì)堅(jiān)持傳統(tǒng)日式飲食習(xí)慣的日本居民和已適應(yīng)西方飲食習(xí)慣的日裔美國(guó)居民的腸道微生物進(jìn)行研究，結(jié)果顯示兩類人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。近些年，Wu等［7］通過(guò)對(duì)98個(gè)健康志愿者的腸道菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)居民的腸道菌群可以劃分為2個(gè)分別以擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）為核心的獨(dú)立無(wú)交集的enterotype類型。enterotype類型的形成與長(zhǎng)期的膳食有關(guān)，與性別以及肥胖等因素?zé)o關(guān)。Wu等進(jìn)一步指出，長(zhǎng)期食用高蛋白質(zhì)高脂肪的食物能夠促使腸道內(nèi)擬桿菌屬（Bacteroides）細(xì)菌的生長(zhǎng)，而食用富含碳水化合物和單糖的食物則可以增加人腸道內(nèi)普氏菌屬（Prevotella）細(xì)菌的含量。

中國(guó)是一個(gè)陸地面積約960萬(wàn)平方千米的大國(guó)，不同地區(qū)具有不同的氣候、文化和飲食習(xí)慣。而不同的人群具有不同的腸道菌群結(jié)構(gòu)［8］。無(wú)錫地處中國(guó)東部長(zhǎng)江三角洲地區(qū)，是傳統(tǒng)的魚米水鄉(xiāng)，受吳文化的浸育，形成了典型的南方生活方式和飲食習(xí)慣，而城市和鄉(xiāng)村因地理位置的不同生活方式也存在差異。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE）是一種不依賴于培養(yǎng)過(guò)程而對(duì)復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效分析的分子生物學(xué)技術(shù)，因其具有低成本、可靠、可重復(fù)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，近些年被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［9］。Yoshida等［10］使用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)太平洋、東海、東京灣以及荒川（Arakawa River）水環(huán)境中的放線菌進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同位置水環(huán)境中的放線菌群落結(jié)構(gòu)不同，且同一水環(huán)境中不同深度微生物群落結(jié)構(gòu)也不同。劉慧杰等［11］通過(guò)使用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)紅樹(shù)林沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，證實(shí)PCRDGGE技術(shù)更能客觀地反映紅樹(shù)林沉積物中真實(shí)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)也證明紅樹(shù)林區(qū)域微生物多樣性豐富，表明未知微生物資源的開(kāi)發(fā)研究具有巨大的潛力。

本文作者應(yīng)用PCR和DGGE相結(jié)合的技術(shù)對(duì)生活于無(wú)錫市區(qū)和鄉(xiāng)村的青年居民腸道菌群多樣性進(jìn)行研究，并結(jié)合城鄉(xiāng)居民生活環(huán)境和飲食習(xí)慣分析，探索了無(wú)錫城鄉(xiāng)居民腸道菌群多樣性的異同。

1 材料與方法

1.1 樣本和試材

1.1.1 樣本來(lái)源 選擇16位居住于無(wú)錫城市和鄉(xiāng)村、近一周內(nèi)無(wú)出行記錄的本地居民為研究對(duì)象，志愿者年齡均在19～35歲，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）在18.5～25.0，近3個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素類藥物攝入，并簽訂知情同意書。同時(shí)，根據(jù)食品頻率問(wèn)卷調(diào)查（Food frequency questionnaire，F(xiàn)FQ）記錄志愿者近3日膳食信息，并根據(jù)《中國(guó)食物成分表》計(jì)算志愿者脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分的日攝入量［12］，樣品采集點(diǎn)分別為無(wú)錫鄉(xiāng)村的濱湖區(qū)和城市的崇安區(qū)，各采樣點(diǎn)間距離近100 km，具體樣品信息見(jiàn)表1。

1.1.2 試驗(yàn)所用試劑 試驗(yàn)所用引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，16S rRNA基因V3區(qū)擴(kuò)增試劑均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，其它試驗(yàn)藥品均為大連寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

表1 樣品信息Table1 Information of subjects

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糞便樣品采集 早餐前分別采集志愿者新鮮糞便樣品適量，放入采樣管中，并立即加入適量保護(hù)劑（Takara Biotechnology，Dalian），糞便和保護(hù)劑體積比為1∶2，迅速在液氮中速凍后存放于冷凍環(huán)境，72 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冷凍儲(chǔ)存以備用。

1.2.2 糞便菌體基因組DNA提取 糞便菌體基因組 DNA的提取使用 QIAamp DNA stool mini kit （Qiagen）試劑盒［13］。得到的基因組DNA用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及A260/A280值，同時(shí)用1 g/dL的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，調(diào)整DNA質(zhì)量濃度至ng/μL水平，于-20℃冷凍保存以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 基因組DNA 16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增 使用通用引物V3F+GC（5′-GCCGCCCGGGGCGCGCC CCGGGCGGCCCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和V3R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）進(jìn)行16S rRNA基因V3區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為220 bp，所用儀器為Applied biosytems公司PCR儀。PCR反應(yīng)體系 （50 μL）為：10×PCR緩沖液5 μL，dNTP （2.5 mmol/μL）4 μL，引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，模板DNA（100 ng/μL）1.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃7 min。得到的PCR產(chǎn)物用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，其余置于-20℃冷凍保存以用于后續(xù)DGGE分析［14］。

1.2.4 糞便菌體基因組DNA變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析 使用 DCode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad）儀器，對(duì)16S rRNA基因V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。分析所用變性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，變性梯度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%～52%，灌膠后電泳在60℃，200 V運(yùn)行5 h。使用銀染方法對(duì)所得膠圖進(jìn)行染色，拍照獲得DGGE指紋圖譜［9］。

1.2.5 乳桿菌屬和雙歧桿菌屬類群定性分析 應(yīng)用乳桿菌屬和雙歧桿菌屬內(nèi)常見(jiàn)種的特異性引物（表2）對(duì)糞便菌體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14-16］，定性分析各目標(biāo)細(xì)菌在樣品中的出現(xiàn)頻率。乳桿菌屬（Lactobacillus）檢測(cè)種包括L.plantarum（植物乳桿菌）、L.salivarius（唾液乳桿菌）、L.casei（干酪乳桿菌）、L.acidophilus（嗜酸乳桿菌）、L.helveticus（瑞士乳桿菌）和L.fermentum（發(fā)酵乳桿菌）；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）檢測(cè)種包括B.longum（長(zhǎng)雙歧桿菌）、B.animalis（動(dòng)物雙歧桿菌）、B.breve（短雙歧桿菌）和B.adolescentis（青春雙歧桿菌）。擴(kuò)增體系（25 μL）為：10×PCR緩沖液 2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/μL）2 μL，引物（10 pmol/μL）各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶 （5 U/μL）0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 4 min；95℃1 min，退火30 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。得到的PCR產(chǎn)物用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)［14］。

表2 乳桿菌屬和雙歧桿菌屬部分種特異性引物Table2 Specific primers of Lactobacillus and Bifidobacterium Species

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 基于Past（Hammer等，2001）軟件，使用Mann-Whitney法對(duì)城鄉(xiāng)樣本營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)z入量和腸道微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.2 DGGE圖譜聚類分析和PCA分析 使用Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜條帶去除背景強(qiáng)度和設(shè)定噪聲水平，自動(dòng)獲得圖譜密度剖面圖，完成條帶檢測(cè)，利用條帶間相似度采用戴斯系數(shù)（Dice coefficient）計(jì)算各樣品間相似性，得到樣品相似性矩陣圖，并用UPGMA算法繪制系統(tǒng)樹(shù)狀圖，完成圖譜聚類分析；同時(shí)使用Past軟件對(duì)相似性矩陣進(jìn)行PCA分析，并用Origin 7.0（Microcal，USA）繪圖軟件繪圖，得到基于PC1和PC2的賦值樣本PCA分布圖［11，17］。

1.3.3 樣品微生物群落多樣性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用多樣性指數(shù)Shannon-Weiner指數(shù)（H）、豐度（S）和均勻度（EH）等指標(biāo)比較樣品的微生物多樣性［11，17］。計(jì)算公式為

公式（1）（2）（3）中，s為每條泳帶中條帶數(shù)目總和，ni為單一條帶i的峰面積，N為所有峰的總面積，Pi為特定條帶亮度相對(duì)于所有條帶總亮度的比率，Hmax是多樣性指數(shù)最大值。通過(guò)軟件自動(dòng)獲得圖譜密度剖面圖并利用條帶間相似度按照上述公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 DGGE條帶的序列測(cè)定 選擇DGGE圖譜中清晰的共性和特異性條帶，標(biāo)記后切膠回收，測(cè)序。測(cè)序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行［11］。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 無(wú)錫城鄉(xiāng)居民腸道微生物PCR-DGGE指紋圖譜

對(duì)樣本通過(guò)基因組DNA提取，16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增和DGGE分析，得到樣本PCR-DGGE指紋圖譜（圖1），每一條泳道代表一位志愿者腸道菌群的DGGE指紋圖譜，不同位置的條帶代表該樣本中不同細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)基因片段，泳道中條帶數(shù)量越多，則說(shuō)明該樣本中含有的微生物豐度越高。

圖1 城鄉(xiāng)居民腸道微生物DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE profiles of intestinal microflora for urban and rural residents

由圖1可知，各樣本含有的條帶數(shù)目不等、位置各異、亮度不同，說(shuō)明無(wú)錫青年居民腸道微生物結(jié)構(gòu)多樣性豐富，且存在個(gè)體差異。

2.2 基于PCR-DGGE指紋圖譜的城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性分析

DGGE指紋圖譜中，每個(gè)泳道中電泳條帶的多少直觀地反映樣本中細(xì)菌群落的多樣性，條帶的亮度反映該細(xì)菌的相對(duì)生物量，泳道中條帶越多，亮度越亮，則表示該樣本中微生物多樣性越豐富，該種屬細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量越多。研究中，依據(jù)電泳圖譜各條帶信息，使用Quantity one軟件計(jì)算各樣本豐度（S）、均勻度（EH）和 Shannon-Weine多樣性指數(shù)（H），以綜合分析城鄉(xiāng)樣本的腸道微生物多樣性（表3）。由表3可知，各樣品均勻度相似，多樣性指數(shù)不同，豐度迥異，這個(gè)結(jié)果與DGGE圖譜的直觀觀測(cè)結(jié)果一致。城市的12號(hào)樣本豐度和多樣性指數(shù)最高，分別為44和3.628 0，表明12號(hào)志愿者腸道微生物多樣性最高；鄉(xiāng)村的7號(hào)樣本豐度和多樣性指數(shù)最低，分別為25和3.005 2，表明7號(hào)志愿者腸道微生物多樣性最低。分別對(duì)城鄉(xiāng)樣本各豐度、多樣性指數(shù)和均勻度求算術(shù)平均值，可知，城市樣本的均勻度、豐度和多樣性指數(shù)均大于鄉(xiāng)村樣本，分別為0.961 7、36.25和3.426 2，0.942 6、35.50和3.350 5。對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），暗示無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著。

表3 城鄉(xiāng)居民樣本DGGE條帶多樣性指數(shù)、豐度及均勻度Table3 Shannon-Wiener Index（H），Richness（S）and Evenness（EH）of DGGE bands for urban and rural residents

2.3 基于PCR-DGGE指紋圖譜的城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物相似性分析

基于DGGE指紋圖譜，計(jì)算各樣品間群落相似性系數(shù)可以得到各樣品細(xì)菌種類差異信息。表4為樣品間微生物群落相似性分析結(jié)果。整體而言，各樣品間的微生物群落相似性系數(shù)介于 18.5%～72.5%，系數(shù)較低，變化區(qū)間較大，說(shuō)明各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，個(gè)體差異明顯，此結(jié)果與DGGE圖譜直觀觀測(cè)結(jié)果以及多樣性分析結(jié)果一致。其中，相似性系數(shù)較高的有鄉(xiāng)村樣本的3號(hào)和6號(hào)、5號(hào)和6號(hào)，系數(shù)分別為71.6%、72.5%；城市樣本的9號(hào)和12號(hào)，14號(hào)和15號(hào)，系數(shù)分別為66.5%、60.9%。相似性系數(shù)較低的有鄉(xiāng)村的4號(hào)和城市的12號(hào)，鄉(xiāng)村的2號(hào)和城市的15號(hào)，以及鄉(xiāng)村的3號(hào)和城市的12號(hào)樣本，分別為18.5%、25.3% 和22.4%，城市樣本和鄉(xiāng)村樣本內(nèi)部相似性系數(shù)較高，城鄉(xiāng)樣本間相似性系數(shù)較低，說(shuō)明城市和鄉(xiāng)村青年居民內(nèi)部腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較高，大于城鄉(xiāng)青年居民之間。此外，表4也顯示，部分城鄉(xiāng)樣本間相似性系數(shù)也較高，如鄉(xiāng)村的8號(hào)和城市的13號(hào)樣本，鄉(xiāng)村的4號(hào)和城市的10號(hào)樣本，系數(shù)分別為64.1%、58.4%；而部分城鄉(xiāng)樣本內(nèi)部相似性系數(shù)較低，如鄉(xiāng)村的2號(hào)和3號(hào)樣本，以及城市的11號(hào)和12號(hào)樣本，相似性系數(shù)為22.2%和27.7%，說(shuō)明部分城鄉(xiāng)居民間腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性也較高，存在個(gè)體差異。

表4 城鄉(xiāng)居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性分析Table4 Similarity coefficients of microbial community of urban and rural residents %

對(duì)圖譜進(jìn)行聚類分析以進(jìn)一步觀察無(wú)錫青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性，見(jiàn)圖2（a），樣本共聚為4簇（族群1—4）。族群1中，城市的9號(hào)和12號(hào)樣本以約66%的相似性聚為一簇；族群2中，城市的14號(hào)和15號(hào)樣本以約60%的相似性聚為一簇；族群3中，鄉(xiāng)村的3號(hào)、5號(hào)和6號(hào)樣本以約69%的相似性聚為一簇；族群4中，城市的11號(hào)、13號(hào)和16號(hào)樣本以約40%的相似性聚為一簇。族群2（城市樣本）和族群3（鄉(xiāng)村樣本）以約35%的相似性聚為一簇，城市或鄉(xiāng)村樣本按照采集地以較高的相似性聚為一簇，城鄉(xiāng)樣本間以較低的相似性聚為一簇，說(shuō)明無(wú)錫城市或鄉(xiāng)村各自青年居民內(nèi)部腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較高，城鄉(xiāng)間則存在差異。族群1、2和4中，鄉(xiāng)村的2號(hào)、7號(hào)、1號(hào)和8號(hào)樣本分別以約63%、53%、40%和80%的相似性與城市樣本集聚為一簇，以及族群4中，城市的10號(hào)樣本和鄉(xiāng)村的4號(hào)樣本以58%的相似性聚為一簇，部分鄉(xiāng)村樣本以一定的相似性與城市樣本集聚，暗示部分鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與城市青年居民相似，這也提示，城鄉(xiāng)比較而言，城市居民的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性更高，個(gè)體差異較小，而鄉(xiāng)村居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)個(gè)體差異較大。

對(duì)圖譜進(jìn)行PCA分析以進(jìn)一步觀察樣本間的集聚趨勢(shì)，如圖2（b）所示，主成分因子PC1的貢獻(xiàn)率為28.07%，主成分因子PC2的貢獻(xiàn)率為16.45%；鄉(xiāng)村樣本集聚于圖形左側(cè)，而大部分城市樣本集聚于圖形右側(cè)，城鄉(xiāng)樣本分別集聚為一簇，并彼此分開(kāi)，說(shuō)明無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)具有分開(kāi)趨勢(shì)；此外，也有兩個(gè)城市樣本與鄉(xiāng)村樣本集聚為一簇的現(xiàn)象存在，說(shuō)明部分無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似。

圖2 基于DGGE指紋圖譜的聚類和PCA分析Fig.2 Analysis of cluster and PCA on DGGE profiles

相似性分析說(shuō)明，居住距離較遠(yuǎn)、生活環(huán)境不同的無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民間腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異較小，相似性小于居住距離較近、生活環(huán)境相似的無(wú)錫城市或鄉(xiāng)村居民內(nèi)部。

2.4 基于PCR-DGGE指紋圖譜對(duì)城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物組成的分析

DGGE指紋圖譜不僅可直觀地反映樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，也可進(jìn)一步通過(guò)切膠回收測(cè)序分析樣本細(xì)菌群落組成。研究中，選取圖譜中具有代表性的共性和特異性條帶（圖1）進(jìn)行膠回收和克隆測(cè)序（表5），以分析不同人群腸道菌群組成的異同。試驗(yàn)中共選取條帶32條，其中11條條帶為所有樣本共有，分別為條帶1、12—20和25，測(cè)序結(jié)果顯示分別為變形菌門 （Proteobacteria）的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），變形菌綱（Alpha proteobacterium）、放 線 菌 門 （Actinobacteria） 的 雙 歧 桿 菌 屬（Bifidobacterium）；條帶2—10、21、23—24、26—29 和31—32共18條條帶是部分城鄉(xiāng)樣本共有，測(cè)序結(jié)果為變形菌門 （Proteobacteria）的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和桿菌屬菌，硬壁菌門（Firmicutes）的葡萄球菌屬 （Staphylococcus）、 乳 桿菌 屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和梭菌屬（Clostridium）；條帶11、22和30共3條條帶為僅鄉(xiāng)村樣本含有而城市樣本不含有，測(cè)序結(jié)果為桿菌屬（Bacterium）菌和變形菌門的不動(dòng)桿菌屬菌。

測(cè)序結(jié)果中，絕大部分條帶的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌的同源性大于98%，有的同源性甚至達(dá)到100%。但是條帶2、10—13、21、23—24、28和31與數(shù)據(jù)庫(kù)中最近親緣菌種間的同源性低于97%，其鑒定結(jié)果分別為不可培養(yǎng)桿菌屬細(xì)菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和Alpha變形菌綱細(xì)菌，因此它們所代表的細(xì)菌有可能為新的不可培養(yǎng)物種及其屬細(xì)菌的新菌種。

測(cè)序結(jié)果表明，城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物組成在門水平上相同，都含有硬壁菌門、放線菌門和變形菌門；在屬水平上沒(méi)有多樣性的差異，但是豐度和數(shù)量上存在差異，其中不動(dòng)桿菌屬、雙歧桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌屬為城鄉(xiāng)青年居民腸道內(nèi)的共有菌屬。

2.5 乳桿菌屬和雙歧桿菌屬類群定性分析結(jié)果

腸道內(nèi)以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為代表的益生乳酸菌，因其可通過(guò)代謝食物中的糖類物質(zhì)生成乳酸及其它代謝物而保護(hù)腸道上皮細(xì)胞，加強(qiáng)腸道自身免疫系統(tǒng)功能，抵抗腸道腫瘤及炎癥等疾病，這些成了近些年食品微生物學(xué)界研究的熱點(diǎn)。本課題研究中使用PCR技術(shù)對(duì)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的若干個(gè)種在無(wú)錫城鄉(xiāng)青年志愿者腸道菌群中的出現(xiàn)頻率進(jìn)行檢測(cè)（表6）。使用瓊脂糖凝膠電泳觀察各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果出現(xiàn)清晰、明亮的條帶，則擴(kuò)增成功，說(shuō)明該樣品中含有該目標(biāo)細(xì)菌，否則則說(shuō)明該樣品中不含有該目標(biāo)細(xì)菌。結(jié)果顯示，乳桿菌屬細(xì)菌中的L.plantarum、L.casei和L.salivarius以及雙歧桿菌屬的B.longum和B.breve的檢出率較高，為90%左右，在無(wú)錫青年居民腸道內(nèi)普遍存在；乳桿菌屬的L.acidophilus和雙歧桿菌屬的B.animalis和B.adolescentis的檢出率適中，約50%～70%，在大部分青年居民腸道內(nèi)存在；L.helveticus和L.fermentum的檢出率較低，為20%左右，在部分城鄉(xiāng)青年居民腸道內(nèi)存在。城鄉(xiāng)比較而言，L. plantarum、L.fermentum、L.salivarius、B.animalis、B. breve和B.longum的檢出率鄉(xiāng)村樣本高于城市樣本，L.helveticus和L.acidophilus的檢出率城市樣本高于鄉(xiāng)村樣本，L.casei和B.adolescentis的檢出率城鄉(xiāng)樣本相同。使用Mann-Whitney分析對(duì)各類菌群在城鄉(xiāng)樣本中的分布進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示均無(wú)顯著性。

表5 腸道菌群PCR-DGGE特征條帶序列比對(duì)結(jié)果Table5 Alignment of intestinal microflora PCR-DGGE band to its most-similar GenBank sequence

表6 城市和鄉(xiāng)村居民腸道中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬各種的定性分析Table6 Qualitative analysis of some Lactobacillus and Bifidobacterium species in intestinal tract of urban and rural residents

分析可知，L.plantarum、L.casei、L.salivarius和L.acidophilus以及B.longum、B.breve、B.animalis 和B.adolescentis分別為無(wú)錫青年居民腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)乳桿菌和雙歧桿菌。城鄉(xiāng)比較而言，各類群菌在居民腸道內(nèi)分布差異不顯著。

3 討論

個(gè)體腸道微生物在經(jīng)歷了嬰兒期的不穩(wěn)定期后，隨著個(gè)體的成長(zhǎng)逐漸成為一個(gè)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，這個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)受人的基因型、性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)、地理環(huán)境、膳食結(jié)構(gòu)，以及生活方式等因素的影響，不同個(gè)體腸道菌群組成不同［1，5］。本課題研究中，DGGE圖譜直觀觀測(cè)結(jié)果和基于圖譜的相似性分析均顯示，無(wú)錫青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)存在個(gè)體差異。與本研究結(jié)果相似，Zoetendal等［18］在使用TGGE技術(shù)對(duì)不同個(gè)體腸道微生物群落研究的報(bào)道中指出，即使是生活在相同環(huán)境、具有相同飲食習(xí)慣的配偶間，腸道菌群也會(huì)顯示出較低的相似性。

盡管人體腸道微生物菌群構(gòu)成個(gè)體差異較大，但研究發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體間有相同的核心菌群存在［19-20］，而生活環(huán)境和飲食方式是引起核心菌群波動(dòng)的主要因素［7-8］。Yatsunenko等［8］對(duì)具有西方飲食習(xí)慣的美國(guó)居民和非西方飲食習(xí)慣的非裔馬拉維及土著印第安居民的腸道菌群進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)美國(guó)居民與馬拉維和印第安居民的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)明顯分離，集聚為不同的簇。Zhang等［21］在使用PCRDGGE技術(shù)對(duì)保持原有生活方式和飲食習(xí)慣的錫林郭勒盟草原蒙古族居民和已趨于現(xiàn)代化生活方式的呼和浩特城市蒙古族居民的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中證實(shí)，城市蒙古族志愿者與草原蒙古族志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異。郭壯［22］亦使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏藏區(qū)居民和城市藏族居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示藏族城市居民樣本與藏區(qū)居民樣本腸道微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的分離現(xiàn)象。本研究中得到了與報(bào)道相似的結(jié)果，基于DGGE圖譜進(jìn)行的相似性分析顯示，無(wú)錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)分開(kāi)趨勢(shì)，相似性小于城市或鄉(xiāng)村青年居民內(nèi)部。不同的生活環(huán)境和生活方式使無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不同。

研究中，基于圖譜的多樣性分析也顯示無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著，定性分析也暗示乳桿菌屬和雙歧桿菌屬各類群細(xì)菌在城鄉(xiāng)青年居民腸道內(nèi)分布無(wú)顯著性差異。與本研究結(jié)果不同，F(xiàn)ilippo等［23］報(bào)道，生活在非洲布基納法索（Burkina Faso）村莊的兒童其腸道菌群的多樣性大于意大利弗羅倫薩（Florence）的城市兒童。郭壯［22］報(bào)道，藏族城市居民腸道菌群的多樣性高于藏區(qū)牧民。近些年隨著社會(huì)的快速發(fā)展，城鄉(xiāng)差距逐漸縮小，飲食方式也日趨同化，結(jié)合居民膳食調(diào)查表進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，城鄉(xiāng)青年居民日常膳食中蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)元素的攝入量相當(dāng)，無(wú)顯著性差異。這些都足以說(shuō)明無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民日常飲食結(jié)構(gòu)已趨相似，相似的飲食習(xí)慣可能是引起城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著的原因。此外，本研究中，研究對(duì)象分別選自同一省市，距離較近（100 km以內(nèi)），居民生活環(huán)境相似，相似的生活環(huán)境可能是引起這一結(jié)果的另一原因。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，無(wú)錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著。通過(guò)DGGE技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法分析無(wú)錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道菌群多樣性的異同，以及對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬乳桿菌屬和雙歧桿菌屬各細(xì)菌種在志愿者腸道中的分布差異進(jìn)行初步的分析，揭示了無(wú)錫城鄉(xiāng)青年居民的腸道微生物多樣性，為后續(xù)國(guó)內(nèi)人群腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步深入研究提供了先例和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］TURNBAUGH P J，LEY R E，HAMADY M，et al.The human microbiome project［J］.Nature，2007，449：804-810.

［2］ECKBURG P B，BIK E M，BERNSTEIN C N，et al.Diversity of the human intestinal microbial flora［J］.Science，2005，308：1635-1638.

［3］ZHU B L，WANG X，LI L J.Human gut microbiome：the second genome of human body［J］.Cell，2010，1（8）：718-725.

［4］MARQUES T M，CRYANA J F，F(xiàn)ERGUS S，et al.Gut microbiota modulation and implications for host health：dietary strategies to influence the gut-brain axis［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2014，22：239-247.

［5］CLEMENTE J C，URSELL L K，PARFREY L W，et al.The impact of the gut microbiota on human health an integrative view［J］. Cell，2012，148：1258-1270.

［6］FINEGOLD S M，ATTEBERY H R，SUTTER V L.Effect of diet on human fecal flora：comparison of Japanese and American diets［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1974，27（12）：1456-1469.

［7］WU G D，CHEN J，HOFFMANN C，et al.Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes［J］.Science，2011，334（6052）：105-108.

［8］YATSUNENKO T，REY F E，MANARY M J，et al.Human gut microbiome viewed across age and geography［J］.Nature，2012，486（14）：226.

［9］劉新宇.土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)種屬特異性檢測(cè)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究［D］.沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，2008.

［10］YOSHIDA A，SEO Y，SUZUKI S，et al.Actinomycetal community structures in seawater and freshwater examined by DGGE analysis of 16S rRNA gene fragments［J］.Marine Biotechnology，2008（10）：554-563.

［11］劉慧杰，楊彩云，田蘊(yùn)，等.基于PCR-DGGE技術(shù)的紅樹(shù)林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50（7）：923-930. LIU Huijie，YANG Caiyun，TIAN Yun，et al.Analysis of microbial community structure in mangrove sediments by PCR-DGGE technique［J］.Acta Microbiologica Sinica，2010，50（7）：923-930.（in Chinese）

［12］楊月欣，王光亞，潘興昌.中國(guó)食物成分表［M］.第2版.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2009.

［13］TANAKA S，KOBAYASHI T，SONGJINDA P，et al.Influence of antibiotic exposure in the early postnatal period on the development of intestinal microbiota［J］.FEMS Immunology and Medical Microbiology，2009，56（1）：80-87.

［14］徐潔.四川地區(qū)不同年齡健康人腸道菌群的比較研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，2012.

［15］?T?EPETOVA J，SEPP E，KOLK H，et al.Diversity and metabolic impact of intestinal Lactobacillus species in healthy adults and the elderly［J］.British Journal of Nutrition，2011，105（8）：1235-1244.

［16］JUNICK J，BLAUT M.Quantification of human fecal Bifidobacterium species by use of Quantitative Real-Time PCR analysis targeting the groEL gene［J］.Applied and Environmental Microbiology，2012，78（8）：2613-2622.

［17］高亦豹，王海燕，徐巖.利用PCR-DGGE未培養(yǎng)技術(shù)對(duì)中國(guó)白酒高溫和中溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（7）：999-1004. GAO Yibao，WANG Haiyan，XU Yan.PCR-DGGE Analysis of the bacterial community of Chinese liquor high and medium temperature Daqu［J］.Microbiology China，2010，37（7）：999-1004.（in Chinese）

［18］ZOETENDAL E G，AKKERMANS A D，De VOS W M.Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16SrRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64（10）：3854-3859.

［19］ARUMUGAM M，RAES J，PELLETIER E，et al.Enterotypes of the human gut microbiome［J］.Nature，2011，473（7346）：174-180.

［20］HAMADY M，KNIGHT R.Microbial community profiling for human microbiome projects：Tools，techniques，and challenges［J］. Genome Research，2009，19（7）：1141-1152.

［21］ZHANG J，ZHENG Y，GUO Z，et al.The diversity of intestinal microbiota of Mongolians living in Inner Mongolia，China［J］. Beneficial Microbes，2013，4（4）：319-328.

［22］郭壯.應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)不同人群腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)食品學(xué)院，2013.

［23］FILIPPO C D，CAVALIERI D，PAOLA M D，et al.Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（33）：14691-14696.

Study on the Diversity of Intestinal Flora of Young Rural and Urban Residents in Wuxi

QIAO Jianmin， ZHANG Jiachao， ZHENG Yi， HOU Qiangchuan，HUANG Weiqiang， HUO Dongxue， GUO Zhuang， ZHANG Heping*
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The gut microbial diversity of young people living in rural and urban Wuxi was studied by the combination of polymerase chain reaction（PCR）and denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）.Based on the DGGE profile，the similarity of volunteers was performed by analysis of clustering and PCA.On the other hand，the diversity was evaluated by the Shannon-Weine index，richness and eveness.The composition of gut microbiota was further characterized by sequencing of the common and special bands of the lanes in DGGE profile.Based on the PCR，the diversity ofLactobacillus and Bifidobacterium species in the gut of rural and urban volunteers was analyzed.The results showed that the structure of gut microbiota between rural and urban residents of Wuxi appeared a separated tendency，and the similarity of intestinal flora between them was lower than that of urban or rural residents alone.Furthermore，the diversity between them were not significantly different.The genus of Acinetobacter，Bifidobacterium，Staphylococcus，Lactobacillus，Clostridium and Ruminococcus were the common bacteria in the gut of young urban and rural residents.All kinds of bacteria of Lactobacillus（L.）and Bifidobacterium（B.）in the gut were not significantly different in rural and urban residents.And the species of L.plantarum，L.casei，L.salivarius，L.acidophilus，B. longum，B.breve，B.animalis and B.adolescentis were the predominant Lactobacillus and Bifidobacterium bacteria，respectively.On the base of the above comprehensive analysis，it can be preliminarily draw a conclusion that the diversity of gut microbiota was not significantly different between the young residents from rural and urban Wuxi.

young rural and urban residents in Wuxi，microbial diversity，PCR，DGGE

Q 93-3

A

1673—1689（2016）08—0839—10

2014-12-09

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-37）。

張和平（1965—），男，內(nèi)蒙古四子王旗人，農(nóng)學(xué)博士，教授，主要從事乳品生物技術(shù)研究。E-mail：hepingdd@vip.sina.com