尚京迎， 付海田， 鄧 超， 張斯秀， 陳敬華*

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

基于巨噬細(xì)胞模型的竹蓀多糖的免疫功能

尚京迎1， 付海田1， 鄧 超2， 張斯秀2， 陳敬華1*

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為探索竹蓀多糖（DI）對巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫功能的影響，分別采用四唑氮藍(lán)（MTT）法、中性紅法、Griess法、ELISA法，檢測DI對巨噬細(xì)胞增殖、吞噬活性、一氧化氮（NO）和白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、α腫瘤壞死因子（TNF-α）分泌量的影響；運用反轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR）檢測iNOS和IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DI能夠明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其吞噬活性。同時，DI能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌NO、IL-1、IL-6、TNF-α的能力，且明顯提高iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)水平。因此，竹蓀多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7具有免疫刺激作用。

多糖；竹蓀；巨噬細(xì)胞；免疫功能

竹蓀（Dictyophora indusiata）是一類大型真菌，屬 于 真 菌 門 （Eumycota）、 擔(dān) 子 菌 亞 門（Basidiomycotina）、腹菌綱（Gasteromycetes）、鬼筆目（Phallales）、 鬼 筆 科 （Phallacefte）、 竹 蓀 屬（Dictyophora），其香味濃郁，滋味鮮美，營養(yǎng)豐富，是當(dāng)今世界上名貴的食用菌之一，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、寧神健體、益氣補(bǔ)腦、潤肺止咳、補(bǔ)氣養(yǎng)陰及清熱利濕等功效［1-2］。

竹蓀多糖是長裙竹蓀的主要活性物質(zhì)。關(guān)于竹蓀多糖的研究，國內(nèi)外主要集中在多糖的提取方法和結(jié)構(gòu)解析上［3-6］，對竹蓀多糖的藥理研究較少。已有部分報道證明，竹蓀多糖具有抗腫瘤、抗氧化等作用［3，7-8］。本文中以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為模型，研討竹蓀多糖對RAW264.7細(xì)胞增殖、吞噬活性，以及 NO、IL-1、IL-6、TNF-α的分泌及iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)的影響，旨在探究竹蓀多糖的免疫調(diào)節(jié)功能，為充分開發(fā)應(yīng)用竹蓀提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每天換液，隔2 d傳代1次，細(xì)胞長至對數(shù)生長期時，按不同實驗?zāi)康奶幚怼?/p>

1.1.2 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，美國Hyclone公司產(chǎn)品；脂多糖（LPS）、MTT，美國Sigma公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒，美國R&D公司產(chǎn)品；RNA提取及純化試劑盒，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Fermenta公司產(chǎn)品；PCR酶，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 竹蓀多糖 竹蓀子實體購自四川省長寧縣，經(jīng)水提醇沉后得粗多糖，再以sevage法脫蛋白質(zhì)，除雜后冷凍干燥得到實驗用的竹蓀多糖。經(jīng)苯酚硫酸法檢測其總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.6%，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.73%。將10 mg竹蓀多糖溶于10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，過濾除菌，－20℃分裝保存。

1.1.4 儀器與設(shè)備 Multiskan GO酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司制造；倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司制造；凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀，美國Bio-Rad公司制造；精密電子天平，美國Mettler Toledo公司制造；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠制造；紫外可見分光光度計，日本日立儀器有限公司制造；FreeZone2.5L冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司制造。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測竹蓀多糖對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h。加入 200 μL不同質(zhì)量濃度 （25、50、100、200 μg/ mL）的竹蓀多糖干預(yù)，同體積的1 μg/mL LPS為陽性對照組，同體積的完全培養(yǎng)液為空白對照組，設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)孵育48 h，然后加入10 μL MTT（5 g/ L）再孵育4 h，離心5 min（3 000 r/min），棄上清液，每孔加100 μL DMSO，避光輕振10 min，酶標(biāo)儀570 nm檢測OD值［9］。

1.2.2 中性紅法檢測竹蓀多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞以3×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。實驗組、空白對照組、陽性對照組處理同1.2.1，48 h后棄上清液，每孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.072%的中性紅溶液，繼續(xù)孵育30 min，棄中性紅，用預(yù)溫的PBS緩沖液洗3遍，每次200 μL，甩干。然后加入冰醋酸-無水乙醇（體積比1∶1）細(xì)胞溶解液100 μL/孔，4℃放置2 h，酶標(biāo)儀550 nm檢測OD值［10］。

1.2.3 Griess法檢測竹蓀多糖對RAW264.7分泌NO的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h。實驗組、空白對照組、陽性對照組處理同 1.2.1，48 h后取上清液，按照Griess試劑盒說明書操作方法檢測NO的生成［10］。

1.2.4 ELISA法檢測竹蓀多糖對RAW264.7分泌細(xì)胞因子的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h。實驗組、空白對照組、陽性對照組處理同 1.2.1，48 h后取上清液，用ELISA試劑盒測定IL-1、IL-6和TNF-α含量，具體操作方法參照試劑盒說明書，酶標(biāo)儀450 nm檢測OD值［9］。

1.2.5 RT-PCR法檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h。實驗組、空白對照組、陽性對照組處理同1.2.1，48 h后吸去上清液，用TRIzol收集細(xì)胞，按照試劑說明提取總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，然后總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增?；蛞镄蛄幸姳?，35個循環(huán)擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳，Image Lab軟件分析［11］。

表1 基因引物序列Table1 List of primers used in polymerase chain reactions

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗，組間的兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹蓀多糖對RAW264.7增殖的影響

巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的基礎(chǔ)是細(xì)胞的存活，存活的狀態(tài)直接影響其功能的發(fā)揮及應(yīng)答的強(qiáng)弱［12］?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以將外源性MTT還原為水不溶性藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，而死細(xì)胞卻無此功能。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，甲臜結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此，通過測定反應(yīng)后的吸光度可以判斷活細(xì)胞的數(shù)量，也能在一定程度上反映細(xì)胞的活性能力。由圖1可知，在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖實驗組吸光度與空白對照組相比較均有顯著性差異 （P＜0.01），與陽性對照組相比較均無顯著性差異 （P＞0.05），說明竹蓀多糖在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的活性，無細(xì)胞毒性。

2.2 竹蓀多糖對RAW264.7吞噬活性的影響

吞噬是巨噬細(xì)胞發(fā)揮其免疫作用的重要方式之一，巨噬細(xì)胞通過吞噬侵入的病原體和體內(nèi)衰老、畸變的細(xì)胞而提高機(jī)體的抗感染能力［12］。中性紅吞噬實驗結(jié)果見圖2。

圖1 竹蓀多糖對RAW264.7增殖的影響Fig.1 DI induced proliferation of RAW264.7 cells

圖2 竹蓀多糖對RAW264.7吞噬活性的影響Fig.2 Effects of DI on phagocytosis of RAW264.7 cells

在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖實驗組對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響明顯高于空白對照組（P＜0.01），且吞噬活性隨干預(yù)濃度的增加而增強(qiáng)；竹蓀多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，其對RAW264.7吞噬功能的促進(jìn)作用與陽性對照組相比較無顯著性差異 （P＞0.05）。表明在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性具有增強(qiáng)作用，且具有濃度依賴性。提示竹蓀多糖對巨噬細(xì)胞的吞噬能力有上調(diào)作用，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物的非特異性免疫反應(yīng)能力。

2.3 竹蓀多糖對NO分泌量的影響

NO是激活的巨噬細(xì)胞殺滅病原微生物及腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，廣泛參與機(jī)體多種生理及病理過程，其可通過作為信使分子以及發(fā)揮自身的細(xì)胞毒性效應(yīng)這兩方面的作用來實現(xiàn)巨噬細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)［13］。根據(jù)Griess法，得到OD540（y）與NO2-濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)方程為

測定樣品的OD540值，通過標(biāo)準(zhǔn)方程計算NO2-的濃度。圖3結(jié)果顯示：當(dāng)竹蓀多糖質(zhì)量濃度為25～200 μg/mL時，與空白對照組相比，實驗組均能夠極顯著地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌NO的能力（P＜0.001）；當(dāng)竹蓀多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，巨噬細(xì)胞分泌NO量最高，接近于陽性對照組（P＞0.05）。表明在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖能激活巨噬細(xì)胞，提高其分泌NO的能力。適量NO的分泌是炎癥反應(yīng)初期機(jī)體對抗炎癥的積極表現(xiàn)，從而實現(xiàn)機(jī)體免疫力的提高。

圖3 竹蓀多糖對NO分泌量的影響Fig.3 Effects of DI on NO production in RAW264.7 cells

2.4 竹蓀多糖對細(xì)胞因子分泌量的影響

當(dāng)機(jī)體受外界因素刺激后，活化的巨噬細(xì)胞作為主要的非特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α等）參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步啟動特異性免疫反應(yīng)，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能，刺激免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)和炎癥介質(zhì)的表達(dá)［14］。因此，通過考察多糖干預(yù)后巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況，可以了解巨噬細(xì)胞的活化程度。

由圖4可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為25～200 μg/mL時，竹蓀多糖顯著性促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1（P＜0.001）；當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，竹蓀多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌 IL-1的量達(dá)到99.07 ng/L，與陽性對照組（98.05 ng/L）相比無顯著性差異（P＞0.05）。說明在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖能激活巨噬細(xì)胞，提高其分泌細(xì)胞因子IL-1的能力。

圖4 竹蓀多糖對IL-1分泌量的影響Fig.4 Effects of DI on IL-1 production in RAW264.7 cells

由圖5可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為25～200 μg/mL時，竹蓀多糖顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6（P＜0.001），并且隨干預(yù)濃度的增加，IL-6分泌量增多 （P＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，竹蓀多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6的量達(dá)到102.11 pg/mL，與陽性對照組（104.79 pg/mL）相比無明顯差異（P＞0.05）。說明在25～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖能激活巨噬細(xì)胞，提高其分泌細(xì)胞因子IL-6的能力，且呈濃度依賴性。

圖5 竹蓀多糖對IL-6分泌量的影響Fig.5 Effects of DI on IL-6 production in RAW264.7 cells

由圖6可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為25～200 μg/mL時，竹蓀多糖顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α（P＜0.001）；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，竹蓀多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的量達(dá)到758.03 ng/L，與陽性對照組的786.17 ng/L比較無明顯差異（P>0.05）。說明竹蓀多糖可激活巨噬細(xì)胞，刺激TNF-α的分泌。

2.5 細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

mRNA是基因與表達(dá)產(chǎn)物間的橋梁，大部分蛋白質(zhì)表達(dá)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平具有相關(guān)性。在多糖的干預(yù)下，巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的增強(qiáng)是提高其細(xì)胞因子分泌量的原因之一［15］。βactin是管家型基因，在所有組織中的表達(dá)相對持續(xù)穩(wěn)定。本實驗以β-actin作為內(nèi)參，運用RT-PCR技術(shù)考察了巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示。

圖6 竹蓀多糖對TNF-α分泌量的影響Fig.6 Effects of DI on TNF-α production in RAW264.7 cells

圖7 細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)Fig.7 Effects of DI on cytokine gene expression by RAW264.7 cells

β-actin各組間條帶亮度相似，說明提取的總RNA量無顯著性差異；與空白對照組比較，不同質(zhì)量濃度的竹蓀多糖干預(yù)巨噬細(xì)胞后iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量都有不同程度的升高；當(dāng)竹蓀多糖質(zhì)量濃度為25 μg/mL時，IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量均較低；當(dāng)竹蓀多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α的條帶亮度均與陽性對照組相似；巨噬細(xì)胞iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量變化趨勢與其分泌NO、IL-1、IL-6、TNF-α的量相關(guān)，推測竹蓀多糖可能通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)，從而實現(xiàn)巨噬細(xì)胞NO、IL-1、IL-6、TNF-α分泌的增加。

3 討論

巨噬細(xì)胞是具有多種功能的免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠分泌促炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等，并且對病原微生物及癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的吞噬能力，在機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。TNF-α是由多種活化的免疫和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子，是特異性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)之間的重要連接紐帶，在宿主防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并且能夠刺激一系列免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)和炎癥介質(zhì)的表達(dá)［14］。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，可以促進(jìn)T、B細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)B細(xì)胞的終末分化及分泌抗體［16］。巨噬細(xì)胞受刺激活化時，釋放的大量NO具有細(xì)胞毒作用，可殺傷腫瘤細(xì)胞，也可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)保護(hù)機(jī)體抵御外界不利因素的侵害［17］。IL-1是活化巨噬細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，不僅能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌IL-12，而且能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能［18］。

作者所在實驗室前期采用熱水浸提獲得的竹蓀子實體多糖為三螺旋構(gòu)象β-（1→3）-D-葡聚糖，體外無抗腫瘤細(xì)胞活性，而動物實驗顯示具有抑制腫瘤生長的效果［8］。由此推測竹蓀多糖是否是通過免疫增強(qiáng)效應(yīng)實現(xiàn)其體內(nèi)抗腫瘤活性。因此，本實驗以巨噬細(xì)胞為模型，研究竹蓀多糖的免疫活性，結(jié)果表明：在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，竹蓀多糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其吞噬活性，促進(jìn)其分泌NO、IL-1、IL-6、TNF-α；與此同時，竹蓀多糖還能增加巨噬細(xì)胞iNOS、IL-1、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)。據(jù)此推測，竹蓀多糖是通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)，從而實現(xiàn)巨噬細(xì)胞NO、IL-1、IL-6、TNF-α分泌的增加。

4 結(jié)語

作者所在實驗室初步證明了竹蓀多糖對巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域。然而，竹蓀多糖激活巨噬細(xì)胞的機(jī)制仍不明了，如其與巨噬細(xì)胞表面何種受體結(jié)合，以及后續(xù)啟動的信號通路有哪些等問題，需要作進(jìn)一步深入研究。

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Immunomodulatory Effects of A Polysaccharide from Dictyophora indusiata on Macrophage

SHANG Jingying1， FU Haitian1， DENG Chao2， ZHANG Sixiu2， CHEN Jinghua1*
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to investigate the immunomodulatory effects of a polysaccharide from Dictyophora indusiata （DI）on the immune function of RAW264.7 cells，the effects of DI on cell proliferation，phagocytosis of RAW264.7 cells，levels of NO，IL-1，IL-6 and TNF-α production were detected by MTT assay，neutral red test，Griess method，and ELISA，respectively.The mRNA expression level of iNOS，IL-1，IL-6 and TNF-α were also measured by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）.The results indicated that DI contributed significantly to the proliferation of the macrophages and the phagocytic activity was at 25～200 μg/mL.In addition，the production of NO，IL-1，IL-6 and TNF-α in macrophages were increased.Further，the expression of iNOS，IL-1，IL-6 and TNF-α mRNA were significantly up-regulated. The DI played immunomodulatory effects on macrophage cell line RAW264.7.

polysaccharide，Dictyophora indusiata，macrophage，immunomodulation

Q 539

A

1673—1689（2016）08—0849—06

2015-01-09

教育部博士點基金項目（20110093110008）。

陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。E-mail:jhchenwhut@126.com