劉興健李皓洋胡小元張志芳易詠竹李軼女

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，鎮(zhèn)江 212018）

豬γ干擾素在家蠶中的表達(dá)和抗病毒活性檢測

劉興健1李皓洋1胡小元1張志芳1易詠竹2李軼女1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，鎮(zhèn)江 212018）

干擾素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中可以用于病毒性傳染病的治療和疫苗免疫效力的提高，用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶中表達(dá)了豬γ干擾素。根據(jù)已發(fā)表的序列對豬γ干擾素基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化并合成，將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393上，與BmBacmid病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系，獲得重組病毒，豬γ干擾素基因位于重組BmNPV病毒的多角體基因啟動子下游。用該重組病毒感染家蠶獲得含有豬γ干擾素的表達(dá)產(chǎn)物。Western blotting檢測到表達(dá)產(chǎn)物中的豬γ干擾素，用微量細(xì)胞病變法利用干擾素抑制VSV-GFP感染VERO細(xì)胞的方法來測定干擾素活性，結(jié)果顯示干擾素效價可以達(dá)到6×105IU/mL以上。在家蠶幼蟲體內(nèi)成功表達(dá)并獲得了有活性的豬γ干擾素。

豬γ干擾素；家蠶；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；抗病毒活性

近年來，我國畜牧業(yè)正全面向規(guī)模化、自動化發(fā)展，生豬規(guī)模化養(yǎng)殖也越來越多，在統(tǒng)一管理、飼養(yǎng)帶來優(yōu)勢的同時，生豬發(fā)生重大疫病所帶來的危害也不斷增大，其中病毒類疾病就是較為嚴(yán)重的一類，常常會在整個養(yǎng)豬場迅速傳播而造成重大經(jīng)濟(jì)損失，因此研制可以廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的高效抗病毒類藥物意義重大。干擾素（Interferon，IFN）是一類在細(xì)胞中廣泛存在的應(yīng)對病毒感染的蛋白家族，1957年，Isaacs在用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)被感染細(xì)胞產(chǎn)生了一種影響其它細(xì)胞從而干擾病毒感染復(fù)制的因子，并將其命名為干擾素［1］，干擾素具有廣譜的抗病毒、腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用［2］，可以被開發(fā)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)的抗病毒藥物。干擾素一般被分為3個類型：I型干擾素包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ等［3］，Ⅱ型干擾素只有IFN-γ一種［4］，Ⅲ型干擾素包括IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28A）、IFN-λ3（IL-28B）、IFN-λ4［5，6］。豬γ干擾素（Porcine interferon γ，PoIFNγ）作為II型干擾素，其在豬體內(nèi)的作用同I型干擾素不同，與α干擾素之間屬于協(xié)同作用，對多種病毒性疾病具有治療效果，如在抑制口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和非洲豬瘟的實驗中有較好的效果。豬γ干擾素基因在豬的基因組中只有一條（GenBank：GU433229.1），基因全長501 bp，共編碼166個氨基酸，其中前23個氨基酸是信號肽序列，后143個氨基酸未成熟的蛋白活性序列，其天然活性狀態(tài)為同源二聚體糖蛋白［7，8］。目前PoIFNγ已經(jīng)在許多表達(dá)體系中進(jìn)行了表達(dá)。

BmBacmid家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是我們結(jié)合常用的Bac-to-Bac、BacPAK6和flashBAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點在BmNPV的基礎(chǔ)上構(gòu)建的一種新型重組病毒構(gòu)建和外源基因表達(dá)系統(tǒng)［9］。該系統(tǒng)可以在大腸桿菌中進(jìn)行基因操作和大量制備，在共轉(zhuǎn)染過程中可以批量制備重組病毒，共轉(zhuǎn)染獲得的重組病毒純合率幾乎達(dá)到100%，適于快速構(gòu)建重組病毒和表達(dá)外源蛋白。

基于關(guān)于豬干擾素抗病毒研究的現(xiàn)狀，本研究根據(jù)公布的豬γ干擾素基因序列以及家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，構(gòu)建含有干擾素基因的重組家蠶桿狀病毒并在家蠶生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)，以期獲得大量具有抗病毒生物活性的豬γ干擾素以及初步建立干擾素快速表達(dá)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和酶類 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Promega，PoIFNγ抗體（兔單抗）購自Millipore，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自MBL，TC100培養(yǎng)基購自Applichem，DMEM（高糖）培養(yǎng)基、FBS購自Gibco，脂質(zhì)體購自Invitrogen。

1.1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393購自Invitrogen，BmBacmid缺陷型桿粒、VSV-GFP病毒（表達(dá)綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎病毒）由本實驗室保存，大腸桿菌Top10、BmN細(xì)胞系、VERO細(xì)胞等為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬γ干擾素基因的獲得 PoIFNγ的基因序列只有一條，為了更好地在我們選用的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)家蠶生物個體內(nèi)的密碼子編碼偏好性對PoIFNγ的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，保持氨基酸序列不變，同時優(yōu)化基因序列中的GC含量并避開常用的酶切位點以保證克隆的方便進(jìn)行，優(yōu)化后在序列的5'端加上BamH I酶切位點序列和Kozak序列，3'端加上終止密碼子和EcoR I酶切位點序列，設(shè)計完成交由南京金斯瑞公司進(jìn)行合成（優(yōu)化后的序列見專利，授權(quán)號：201210110533.6），合成的基因連接在pUC57-simple載體上，得到含有豬γ干擾素基因的質(zhì)粒pUC-PoIFNγ。

1.2.2 豬γ干擾素基因插入到轉(zhuǎn)移載體上 將pUCPoIFNγ載體用BamH I-EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收510 bp左右的目的片段，與進(jìn)行同樣酶切處理的pVL1393轉(zhuǎn)移載體用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在Amp抗生素的LB平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的克隆，利用質(zhì)?？焖俅痔岬姆椒êY選出陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定篩選出連接有相應(yīng)大小目的片段的克隆，測序鑒定確認(rèn)PoIFNγ基因連接到轉(zhuǎn)移載體上獲得了pVL1393-PG。

1.2.3 家蠶細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備 根據(jù)Summers的操作手冊［10］，用含有FBS的TC100昆蟲培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶BmN細(xì)胞系，達(dá)到合適的濃度后接種到六孔板中或者35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿上（1×106cells/mL）培養(yǎng)8-12 h，用于共轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組病毒。

1.2.4 重組桿狀病毒的構(gòu)建 根據(jù)失活拯救型BmBacmid構(gòu)建重組病毒的方法［9］，將適量的轉(zhuǎn)移載體pVL1393-PG和純化的BmBacmid病毒DNA混合后加入脂質(zhì)體，室溫孵育20 min，共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系，27℃培養(yǎng)4-5 d后待細(xì)胞感染發(fā)病并剝落后收集共轉(zhuǎn)染上清液，獲得重組病毒reBm-PG。

1.2.5 斑篩選高表達(dá)重組病毒 在35 mm培養(yǎng)皿中種上適量的BmN細(xì)胞并在27℃培養(yǎng)12 h，將含有重組病毒的共轉(zhuǎn)染上清液稀釋100倍，取10 μL稀釋液感染BmN細(xì)胞，27℃孵育1 h后將無血清TC100培養(yǎng)基換成含10%血清、1%低熔點凝膠的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5-6 d后挑取病毒斑獲得單獨的毒株，在24孔板中用液體TC100培養(yǎng)的BmN細(xì)胞系擴(kuò)增篩選的病毒，用干擾素基因特異引物鑒定擴(kuò)增的病毒，最終獲得24個reBm-PG的重組病毒毒株。

1.2.6 豬γ干擾素在家蠶中的表達(dá) 用共轉(zhuǎn)染獲得的重組病毒或者斑純化獲得的重組病毒注射感染5齡起家蠶（105pfu/頭），在濕度65%，溫度25-27℃條件下培養(yǎng)108-120 h，觀察家蠶發(fā)病情況并收集含有重組PoIFNγ表達(dá)產(chǎn)物的蠶血淋巴，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 Western Blotting檢測豬γ干擾素表達(dá) 將收集的蠶血淋巴用PBS稀釋5倍后超聲波破碎，離心去掉細(xì)胞碎片，用上清液進(jìn)行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用3% BSA封閉后依次用抗豬γ干擾素的兔一抗（1∶800稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋）孵育，最后用ECL發(fā)光液顯色成像。

1.2.8 豬γ干擾素抗病毒活性檢測 用微量細(xì)胞病變抑制法檢測豬γ干擾素的活性［11］。用VSV-GFP病毒感染豬γ干擾素處理過的VERO細(xì)胞，通過綠色熒光反映的病毒感染發(fā)病情況來檢測其抗病毒活性。操作方法如下：在96孔板中接種VERO細(xì)胞（2×105-3×105cells/mL），37℃貼壁培養(yǎng)8-12 h；含有豬γ干擾素的蠶血淋巴超聲破碎后離心去除細(xì)胞碎片，再用0.2 μm濾膜過濾除菌，用含有FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至不同梯度，分別用100 μL稀釋液在96孔板中孵育VERO細(xì)胞12 h左右；去除96孔板中每孔中孵育培養(yǎng)基，加入100 μL含有100TCID50的VSV-GFP病毒的DMEM培養(yǎng)基，37℃侵染1 h；棄掉含有病毒的培養(yǎng)基，換成正常含有FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染情況。

最初的抗病毒活性檢測中估算樣品稀釋梯度，確定一定的范圍后設(shè)計合適的稀釋梯度來計算最準(zhǔn)確的抗病毒活性，按照Reed-Muench法計算干擾素的效價。

2 結(jié)果

2.1 含有PoIFNγ的轉(zhuǎn)移載體的獲得

對獲得的pVL1393-PoIFNγ質(zhì)粒進(jìn)行BamH I-EcoR I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物（圖1），9 kb左右片段為pVL1393載體片段，500 bp左右片段為PoIFNγ片段，說明豬γ干擾素成功插入到pVL1393轉(zhuǎn)移載體的MCS序列中，后續(xù)的測序進(jìn)一步驗證了該結(jié)果。

圖1 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1393-PG酶切鑒定

2.2 豬γ干擾素在蠶血淋巴中的表達(dá)

對蠶血淋巴表達(dá)樣品超聲破碎處理后進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果（圖2）顯示在20 kD左右特異性雜交條帶，大小符合預(yù)期，說明利用該家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶中成功獲得了豬γ干擾素的表達(dá)。

圖2 重組γ干擾素的Western blotting分析

2.3 豬γ干擾素抗病毒活性檢測

在其抑制細(xì)胞病變的實驗中，首先以干擾素表達(dá)產(chǎn)物稀釋102-107倍數(shù)（10倍遞增）確定活性精確測定稀釋倍數(shù)區(qū)間，此區(qū)間為104-106之間，再以8×103為最低稀釋倍數(shù)，2倍遞增，精確測定不同稀釋梯度的PoIFNγ表達(dá)產(chǎn)物處理的VERO細(xì)胞抗VSV-GFP病毒感染情況來計算干擾素的抗病毒活性。將VERO細(xì)胞用VSV-GFP侵染后的發(fā)病情況按照綠色熒光的比例分為4個等級：完全沒有感染發(fā)病、少量細(xì)胞感染并表達(dá)綠色熒光蛋白和50%以上的細(xì)胞感染病表達(dá)綠色熒光蛋白（圖3）。

圖3 VERO細(xì)胞病變熒光表達(dá)情況

根據(jù)在表1中記錄的細(xì)胞感染發(fā)病情況計算，在蠶血淋巴中表達(dá)的PoIFNγ抗病毒效價可以達(dá)到6×105IU/mL。通多對斑純化篩選得到的24個重組病毒株在家蠶中表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性檢測可以得到活性提高2-3倍的產(chǎn)物。

表1 重組豬γ干擾素抗病毒活性檢測結(jié)果

3 討論

豬γ干擾素在天然狀態(tài)下是同源二聚體的結(jié)構(gòu)，在這個結(jié)構(gòu)下才有活性。人們開始用大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)這種干擾素時，產(chǎn)物基本無活性，通過對產(chǎn)物的變性再復(fù)性后才能檢測到抗病毒效力［7］。后來人們陸續(xù)在畢赤酵母［12，13］、哺乳動物細(xì)胞［14］和AcNPV桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)［15］進(jìn)行了豬γ干擾素的表達(dá)。畢赤酵母中表達(dá)產(chǎn)物純化后抗病毒活性可達(dá)1.67×106IU/mg，相當(dāng)于產(chǎn)物原液表達(dá)量約為2×105IU/mL，本研究獲得的初步表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性可以達(dá)到5×105IU/mL，有所提高。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，適于真核來源的外源蛋白的表達(dá)，能夠形成正確的折疊和后期修飾，包括糖苷化、脂肪酸?；?、乙酰化等，最大程度的保證表達(dá)的重組蛋白可以成為天然狀態(tài)具有生物活性［16］。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的一種也具有以上優(yōu)點，另外在家蠶中還存在特有的N端糖基化過程，更加有利于外源基因的表達(dá)［17］。有研究報道稱桿狀病毒可以在哺乳動物細(xì)胞上誘導(dǎo)引發(fā)基礎(chǔ)免疫［18］，這一點使得利用該系統(tǒng)表達(dá)的重組PoIFNγ在抗病毒時受到協(xié)同促進(jìn)作用，更加有利于抗病毒應(yīng)用。在我國家蠶可以大規(guī)模飼養(yǎng)，并且生產(chǎn)周期短、生物安全性高、生產(chǎn)成本低。因此，使用重組桿狀病毒在家蠶體內(nèi)表達(dá)豬γ干擾素是一個很好的選擇。

本研究中Western blotting結(jié)果驗證了干擾素的表達(dá)，以野生BmNPV病毒感染家蠶的表達(dá)產(chǎn)物為對照，重組病毒感染表達(dá)產(chǎn)物中檢測到了干擾素特異性的條帶，大小與預(yù)期一致。而抗病毒活性檢測中則進(jìn)一步驗證了表達(dá)出的干擾素是有高抗病毒活性的，同已報道的表達(dá)情況相比，目前該基因在我們系統(tǒng)中的表達(dá)可以達(dá)到較高的水平，較大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)高，可以達(dá)到甚至超過AcNPV-cells表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量，并且成本更低。細(xì)胞病變抑制法中用GFP報告基因監(jiān)測VSV病毒感染的情況使得抗病毒活性檢測更加方便、靈敏、準(zhǔn)確。

根據(jù)干擾素在生物體內(nèi)的作用，可以開發(fā)為病毒類疾病的治療制劑和疫苗注射時的免疫增強(qiáng)劑等，豬α干擾素在家蠶中的表達(dá)已經(jīng)成功，并且具有抗病毒生物活性［19］，如果將兩種干擾素聯(lián)合應(yīng)用，應(yīng)該會提高抗病毒活性。本研究利用病毒復(fù)制缺陷型桿?？焖贅?gòu)建了重組病毒并實現(xiàn)了干擾素在家蠶中的表達(dá)，為進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)相應(yīng)的畜牧養(yǎng)殖業(yè)免疫和治療藥劑提供了條件。下一步實驗將會針對表達(dá)產(chǎn)物的純化和保存以及劑型等方面的內(nèi)容進(jìn)行相應(yīng)的研究，并且需要將表達(dá)方法和毒種穩(wěn)定的方法確定下來，以更利于之后的相關(guān)應(yīng)用研究。

4 結(jié)論

本研究成功利用BmBacmid系統(tǒng)構(gòu)建了含有豬γ干擾素的重組家蠶桿狀病毒reBm-PG，并在家蠶生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)免疫印跡和抗病毒檢測結(jié)果，豬γ干擾素在家蠶中有表達(dá)并且表達(dá)產(chǎn)物具有較高的抗病毒活性。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

Expression and Antiviral Activity Detection of Porcine Interferongamma in Silkworm

LIU Xing-jian1LI Hao-yang1HU Xiao-yuan1ZHANG Zhi-fang1YI Yong-zhu2LI Yi-nü1
（1. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural，Beijing 100081；2. Sericultural Research Institute，Chinese Academy of Agricultural，Zhenjiang 212018）

Interferon is used for threating viral infectious diseases and enhancing vaccine efficacy in stockbreeding. In this study，recombinant porcine interferon-gamma（PoIFNγ）was expressed in silkworm by using Baculovirus expression vector system. Based on the published sequences， the gene of PoIFNγ was artificially synthesized after codon optimization. The optimized gene was firstly cloned into pVL1393 transfer vector of Baculovirus， with virus BmBacmid DNA which was co-transfected into BmN cell line， and recombinant BmNPV was obtained. The PoIFNγ gene was in the downstream of polyhedrosis gene promoter in BmNPV. The silkworm larva infected with recombinant BmNPV gained the expression of PoIFNγ that was detected by Western blotting. The activity of interferon was measured by using microcytopathic method that uses interferon to inhibit the VSV-GFP infecting VERO cells. The results showed that the titer of interferon was over 6×105IU/mL. The activated PoIFNγ was successfully expressed in silkworm larvae.

porcine interferon-gamma；silkworm；Baculovirus expression system；antiviral activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.024

2015-05-27

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”（2011AA100603），國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2012CB114600）

劉興健，男，博士研究生，研究方向：病毒分子生物學(xué)；E-mail：liuxingjian87@gmail.com

李軼女，女，副研究員，研究方向：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；E-mail：liyinv@caas.cn