盧彩平　趙曉建　趙亞紅　褚偉偉　蘇白玉　任巧華

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·論著·

普羅布考干預大鼠非酒精性脂肪肝形成的作用及機制研究

盧彩平趙曉建趙亞紅褚偉偉蘇白玉任巧華

目的探究普羅布考對大鼠非酒精性脂肪肝形成作用的干預情況及干預機制。方法選取30只SD大鼠，將其隨機分為空白組、高脂組及研究組，每組10只。給予相應喂養(yǎng)方法，通過高脂飲食誘發(fā)實驗大鼠出現(xiàn)NAFLD，建立模型，喂養(yǎng)18周后，處死全部大鼠，并進行血脂及肝功能相關指數(shù)，即TC、TG、AST、ALT及HDL與LDL水平，計算肝臟指數(shù)同時檢測其肝臟組織FXR、SHP及SREBP-1c mRNA表達情況。結果3組大鼠肝臟病變程度均以高脂組最高，空白組最低，研究組脂肪性病變、炎性程度及纖維化病變評分分別為(2.97±0.18)分、(1.29±0.27)分及(0.05±0.02)分，均位于其他2組評分之間。高脂組與研究組TC、ALT、AST及LDL與空白組比較均明顯升高，且高脂組升高程度更為明顯(P<0.05)，空白組FXR、SHP及SREBP-1c的mRNA水平分別為(0.92±0.42)β-actin、(1.01±0.60)β-actin、(0.68±0.27)β-actin，各檢測項目均顯著高于高脂組(P<0.05)，研究組FXR、SHP的mRNA表達水平位于其他2組之間，分別為(0.28±0.13)β-actin及(0.42±0.23)β-actin，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SREBP-1c的mRNA表達水平為(0.68±0.22)β-actin，與空白組基本相同(P>0.05)。結論普羅布考對由高脂飲食導致的大鼠NAFLD癥狀具有一定的預防作用，可明顯減輕由該因素導致的大鼠肝臟出現(xiàn)脂肪性樣變情況，其預防機制為該藥物提高了大鼠機體的抗氧化能力，從而降低了組織出現(xiàn)氧化應激而導致的損傷。

普羅布考；非酒精性脂肪肝；干預

非酒精性脂肪肝(NAFLD)主要是由于遺傳、環(huán)境及生活方法等多種因素所共同導致的代謝性綜合征，有研究表明，該病癥的產(chǎn)生與胰島素抵抗及2型糖尿病具有一定聯(lián)系[1]。目前，對該病致病機制較為認同的解釋為患者出現(xiàn)胰島素抵抗，進而導致機體出現(xiàn)氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應[2]，并對肝細胞造成一定影響，并導致患者出現(xiàn)脂肪性肝炎。因此，對該疾病的治療以采用抗氧化劑，增強機體抗氧化能力為主。普羅布考是一種抗氧化作用很強的制劑，研究表明，其抗氧化作用遠高于尼莫地平及卡托普利等常規(guī)藥物[3],其抗氧化能力分別是維生素E、尼莫地平、維拉帕米、卡托普利的5～6倍、16倍、95.5倍和104倍。研究人員通過對大鼠進行普羅布考研究，發(fā)現(xiàn)其對NAFLD的形成可起到一定的抑制作用。本次研究通過高脂飲食誘導非酒精性脂肪肝模型，探究普羅布考對NAFLD的預防作用及機制，報告如下。

1　材料與方法

1.1動物分組選取30只SD大鼠(由吉林大學醫(yī)學部實驗動物中心提供)，均為雄性，體重(208.26±10.15)g，進行5 d的適應性飼養(yǎng)，之后將其隨機分為3組，每組10只，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)；高脂組給予高脂飼料[4](配方：80%普通飼料，10%豬油，5%豆油，2%蔗糖及3%膽固醇)；研究組給予高脂飼料的同時，采用500 mg·kg-1·d-1劑量的普羅布考試劑進行灌胃處理。喂養(yǎng)時間18周。

1.2標本采集喂養(yǎng)結束后，將全部大鼠處死，并進行血清分離及肝部采樣操作，將每只大鼠肝部組織分為3份：(1)于-80℃環(huán)境下保存，之后行肝脂質(zhì)水平檢測[5]；(2)采用濃度為15%的甲醛進行固定，并進行病理學診斷；(3)采用濃度為4%的戊二醛進行固定，并進行透射電鏡對肝細胞結構進行觀察。

1.3方法

1.3.1病理學檢查:將肝組織進行常規(guī)包埋并進行切片處理，采用蘇木精及伊紅進行染色，之后，由病理學學者對其進行光鏡下檢查，并對肝組織脂肪樣變、纖維化樣變及病灶數(shù)目進行評分，分數(shù)0～5分，病變程度越高，得分越高，每張切片觀察數(shù)目為9個視野。

1.3.2檢測指標:檢測其血脂及肝功能相關指數(shù)，即TC、TG、AST、ALT及HDL與LDL水平，對各大鼠肝臟重量進行測量，并計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重)，同時檢測其肝臟組織FXR、SHP及SREBP-1c mRNA表達情況。

2　結果

2.13組大鼠肝臟形態(tài)特點比較空白組大鼠肝臟呈鮮紅色，且邊緣清晰，光鏡下觀察結果顯示結構規(guī)整，小葉組織清晰，界板規(guī)則行高，肝索為單層結構、細胞呈多變形且較大，無明顯異常；高脂組大鼠肝臟體積與其他兩組相比明顯增加，且呈淺黃色并伴有油膩感，肝組織邊緣與空白組相比明顯變鈍，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，肝小葉結構性差，可發(fā)現(xiàn)肝細胞脂肪樣變程度深，并伴有一定程度的肝組織病灶樣壞死及輕中度炎性癥狀，少數(shù)大鼠肝組織出現(xiàn)片狀壞死并伴有程度較深的纖維性樣變，中央靜脈也出現(xiàn)一定程度的炎癥現(xiàn)象并伴有纖維性樣變；研究組大鼠肝臟顏色、大小及邊緣情況介于空白組與高脂組之間，光鏡下觀察，仍可發(fā)現(xiàn)其小葉結構，且邊界規(guī)則性較高，肝細胞出現(xiàn)一定程度的脂肪性樣變及炎性反應，但程度不及高脂組，中央靜脈存在輕度擴張現(xiàn)象并伴有輕度炎性反應。見圖1～3。

圖1 空白組大鼠肝臟病理(HE×100)圖2 高脂組大鼠肝臟病理(HE×200)圖3 研究組大鼠肝臟病理(HE×200)

2.23組大鼠肝細胞超微結構比較空白組大鼠肝細胞超微結構正常；高脂組大鼠干細胞可見數(shù)目較多的圓形或類圓形脂滴物質(zhì)，細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部分與正常大鼠肝細胞內(nèi)線粒體存在明顯差異，主要為線粒體大部分脊與膜發(fā)生融合或未能觀察到脊，且外層核膜也出現(xiàn)融合或消失現(xiàn)象愛那個，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象明顯，微絨毛數(shù)量顯著降低，且纖維化明顯；研究組大鼠肝細胞與正常結構存在明顯差異，但病變程度未達到高脂組水平，細胞內(nèi)可見少量脂滴，線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)病變程度較輕。見圖4～6。

2.3比較3組大鼠肝臟病變程度3組大鼠肝臟病變程度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組大鼠肝臟表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)脂肪性病變、炎癥程度及纖維化病變等癥狀，3項對比數(shù)據(jù)中，均以高脂組最高，空白組最低，研究組脂肪性病變、炎癥程度及纖維化病變評分分別為(2.97±0.18)分、(1.29±0.27)分及(0.05±0.02)分，均位于其他2組評分之間。見表1。

圖4 空白大鼠肝臟超微結構(×15000)圖5 高脂大鼠肝臟超微結構(×15000)圖6 研究組大鼠肝臟超微結構(×15000)

表1　3組大鼠肝臟病變程度　n=10,分,

注：與空白組比較，*P<0.05；與高脂組比較，#P<0.05

2.4比較3組大鼠血脂及肝功能指數(shù)高脂組與研究組TC、ALT、AST及LDL與空白組比較均明顯升高，且高脂組升高程度更為明顯(P<0.05)，研究組TC、ALT、AST及LDL水平分別為(2.98±0.91)mmol/L、(79.61±18.49)U/L、(178.35±29.58)U/L及(2.04±0.49)mmol/L。研究組TG水平與另2組比較，顯著提

高(P<0.05)，HDL水平則以空白組最高，其他2組數(shù)值基本相同分別為(0.84±0.18)mmol/L及(0.85±0.16)mmol/L。見表2。

2.5比較3組大鼠肝臟組織FXR、SHP及SREBP-1c mRNA表達情況空白組FXR、SHP及SREBP-1c的mRNA水平分別為(0.92±0.42)β-actin、(1.01±0.60)β-actin、(0.68±0.27)β-actin，各檢測項目均顯著高于高脂組(P<0.05)，研究組FXR、SHP的mRNA表達水平位于其他2組之間，分別為(0.28±0.13)β-actin及(0.42±0.23)β-actin，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SREBP-1c的mRNA表達水平為(0.68±0.22)β-actin，與空白組基本相同，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2　3組大鼠血脂及肝功能指數(shù)　±s

注：與空白組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

組別FXRSHPSREBP-1c空白組0.92±0.421.01±0.600.68±0.27高脂組0.16±0.12*0.13±0.11*0.82±0.42*研究組0.28±0.13*#0.42±0.23*#0.68±0.22#

注：與空白組比較，*P<0.05；與高脂組比較，#P<0.05

2.63組大鼠肝指數(shù)空白組、高脂組及研究組大鼠肝指數(shù)分別為(2.30±0.18)%，(3.51±0.42)%及(3.45±0.29)%。

3　討論

NAFLD是目前人們患有的常見疾病，主要由遺傳因素及飲食結構導致[6]，其產(chǎn)生機制主要由于活性氧簇(ROS)作用，研究發(fā)現(xiàn)，隨著體內(nèi)游離脂肪酸(FFA)的增加，極易導致肝細胞出現(xiàn)脂肪性樣變，同時，機體內(nèi)大量活性因子參與該過程，并導致機體產(chǎn)生較多的ROS，當ROS水平達到機體抗氧化能力最大水平時，過量的氧化產(chǎn)物將對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸造成一定損傷，造成大量肝細胞死亡，同時對肝庫普弗細胞造成一定刺激，導致肝細胞出現(xiàn)纖維化。普羅布考是一種降脂藥物，常被用于治療高膽固醇血癥，而由于其具有較強的抗氧化應急作用，近年來又被廣泛用于治療動脈粥樣硬化及其他心腦血管疾病。由于其降脂作用及抗氧化作用顯著，因此可大幅度提升機體抗氧化能力，使機體可耐受更高水平的ROS，同時，由于三酰甘油主要由肝臟產(chǎn)生，且肝內(nèi)三酰甘油含量過多也易導致肝臟損傷，因此普羅布考可通過提高機體抗氧化性及降低三酰甘油，起到對肝臟的保護及對肝細胞出現(xiàn)脂肪性樣變的預防作用。

本次研究中，通過給予實驗大鼠高脂飲食，誘導其出現(xiàn)NAFLD，并進行普羅布考干預研究。本次研究采用的高脂飲食，在相關學者提出的配比中提高玉米油及蔗糖所占比例，使其與人們常規(guī)飲食更為接近，同時增加大鼠食欲，提高實驗效果[7]。

18周后，對大鼠進行處死并觀察其肝臟變化，發(fā)現(xiàn)高脂組大鼠肝臟有明顯增大且顏色變黃并伴有油膩感，肝內(nèi)出現(xiàn)脂肪沉積現(xiàn)象[8]，并同時伴有一定程度的炎性反應及纖維化病變，與空白組大鼠肝臟比較存在明顯不同，說明通過高脂飲食誘導大鼠形成NAFLD模型辦法可行[9]，同時，自研究組進行高脂飲食的同時給予其適量的普羅布考，結果為研究組大鼠肝臟增大及脂肪性樣變情況與高脂組比較進展較輕，且實驗室檢測結果顯示，高脂組與研究組TC、ALT、AST及LDL與空白組比較均明顯升高，且高脂組升高程度更為明顯(P<0.05)，研究組TG水平與另2組比較，顯著提高(P<0.05)，HDL水平則以空白組最高，其他2組數(shù)值基本相同。提示普羅布考對NAFLD具有一定的預防作用，可減緩NAFLD的病變速度，以達到對肝臟的保護作用[10,11]。

空白組FXR、SHP及SREBP-1c的mRNA水平分別為(0.92±0.42)β-actin、(1.01±0.60)β-actin、(0.68±0.27)β-actin，各檢測項目均顯著高于高脂組(P<0.05)，研究組FXR、SHP的mRNA表達水平位于其他2組之間，分別為(0.28±0.13)β-actin及(0.42±0.23)β-actin，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SREBP-1c的mRNA表達水平為(0.68±0.22)β-actin，與空白組基本相同(P>0.05)。FXR主要由膽汁激活，之后，可激活SHP，實際發(fā)生作用，SHP作為一種抑制性核受體，通過對肝X受體的抑制作用，使SREBP-1c的表達水平下降[12]。SREBP-1c是對TG的調(diào)控、脂肪酸和TCH 的合成以及調(diào)控LDL代謝相關基因表達的轉錄因子，尤其在肝臟發(fā)生脂肪性樣變使發(fā)揮重要作用。SREBP-1c表達效果降低可抑制脂肪酸合酶的活性，最終大量減少患者體內(nèi)TG含量[13]。有相關學者研究發(fā)現(xiàn)，藥物可通過FXR-SHP-SREBP-1c通路治療NAFLD[14]。另有研究人員指出，在給予NAFLD大鼠服用降脂藥普羅布考后，與NAFLD模型組相比，普羅布考組大鼠FXR、SHP的mRNA水平及蛋白表達水平有明顯上升，而SREBP-1c的mRNA表達水平及蛋白表達則出現(xiàn)下降現(xiàn)象，因此普羅布考改善NASH 大鼠肝功及肝臟脂肪變性的作用與上調(diào)膽汁酸受體FXR 的表達水平有關[15]。該試驗與本次研究結果基本相符，本次研究中，SREBP-1c的mRNA表達水平與空白組基本相同，可能與本次研究中普羅布考使用量及本次研究中采用的大鼠體質(zhì)有關。還有相關學者經(jīng)研究表明，給予大鼠一定量的普羅布考后，與常規(guī)喂養(yǎng)及高脂喂養(yǎng)相比，普羅布考組MDA、SOD及GSH-PX水平均位于空白組及高脂組之間，且組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明普羅布考具有顯著的抗氧化作用，通過提高機體抗氧化能力，減輕過氧化過程中對機體的影響[16]。

總之，普羅布考對由高脂飲食導致的大鼠NAFLD癥狀具有一定的預防作用，可明顯減輕由該因素導致的大鼠肝臟出現(xiàn)脂肪性樣變情況，其預防機制為該藥物提高了大鼠機體的抗氧化能力，從而降低了組織出現(xiàn)氧化應激而導致的損傷。

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Study on the effects and action mechanism of probucol on the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver in rats

LUCaiping*,ZHAOXiaojian,ZHAOYahong,etal.

*DepartmentofEndocrinology,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo observe the effects of probucol on the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver (NAFLD) in rats,and to explore its action mechanism. MethodsThirty SD rats were randomly divided into blank control group, high fat group and observation group, with 10 rats in each group. The rats were fed with high fat diet for 18 weeks to induce NAFLD models.Then all the rats were sacrificed,and the serum levels of blood lipid and liver function related indexes including TC, TG, AST, ALT,HDL and LDL were detected,at the same time, the expression levels of FXR and SHP and SREBP-1c mRNA were measured.ResultsAmong the 3 groups, the degree of liver lesions in high fat group was the severest,which in blank control group was the slightest.The fatty pathological changes, severity of inflammation and fibrosis lesion scores in observation group were (297±0.18) points, (1.29±0.27) points and (0.05±0.02) points,respectively,which were located between the other two groups. The serum levels of TC,ALT, AST and LDL in high fat group were significantly increased,as compared with those in blank control group and observation group, moreover, the increase degree in high fat group was more obvious (P<0.05).The expression levels of FXR, SHP and SREBP-1c mRNA in blank control group were (0.92±0.42)β-actin,(1.01±0.60)β-actin,(0.68±0.27)β-actin,respectively,which were significantly higher than those in high fat group (P<0.05). The expression levels of FXR, SHP mRNA in observation group were (0.28±0.13)β-actin and (0.42±0.23)β-actin,respectively,there were significant differences between observation group and the other two groups (P<0.05). However the expression levels of SREBP-1c mRNA in observation group were (0.68±0.22)β-actin, there were no significant differences between observation group and blank control group (P>0.05). ConclusionThe probucol has certain preventive effects on NAFLD in rats induced by high fat diet,which can obviously relieve liver fatty degeneration of rats,and the action mechanism may be correlated to the enhancement of antioxidation ability of rats to reduce the incidence rate of tissue lesion caused by oxidative stress.

probucol;non-alcoholic fatty liver; intervention

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.19.009

050011河北省石家莊市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科(盧彩平、蘇白玉、任巧華)，胸外科(趙曉建、褚偉偉)，腫瘤科(趙亞紅)

R 575.5

A

1002-7386(2016)19-2919-04

2016-04-11)

項目來源：河北省科學技術研究與發(fā)展指導計劃項目(編號：132777200)