王　云　陳　敏　陳　駿　李運(yùn)紅　諸葛宇征

南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院(210008)

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Claudin-4在膽管癌中的表達(dá)及其臨床意義*

王云#陳敏陳駿李運(yùn)紅&諸葛宇征&

南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院(210008)

背景：膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤。Claudin-4是細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組分，上皮腫瘤中普遍存在claudin-4表達(dá)異常，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。目的：分析claudin-4在膽管癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。方法：應(yīng)用免疫組化方法檢測claudin-4在77例膽管癌及其配對癌旁組織中的表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，同時以Kaplan-Meier生存曲線行生存分析。結(jié)果：膽管癌組織中claudin-4以強(qiáng)陽性表達(dá)為主，癌旁組織以中等和弱陽性表達(dá)為主，癌組織免疫組化評分顯著高于癌旁組織(9.22±3.62對7.12±4.26,P<0.05)。膽管癌組織中的claudin-4表達(dá)與腫瘤部位和分化程度顯著相關(guān)(P均<0.05)，低分化腺癌高表達(dá)率顯著高于高-中分化腺癌(76.2%對50.0%)。Claudin-4低表達(dá)組和高表達(dá)組31個月累積生存率分別為29.8%和21.1%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：Claudin-4在膽管癌中呈異常高表達(dá)，并與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，因此有望成為膽管癌診斷新的生物學(xué)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

膽管腫瘤；預(yù)后；Claudin-4；免疫組織化學(xué)

Background: Cholangiocarcinoma (CCA) is a fatal digestive system tumor arising from biliary epithelium. Claudin-4, a key constituent of intercellular tight junction, is aberrantly and widely expressed in various epithelial tumors, and is correlated with tumorigenesis and tumor progression. Aims: To investigate the expression of claudin-4 in CCA and its correlation with clinicopathological characteristics of the tumor and patient’s prognosis. Methods: Immunohistochemistry was used to determine the expression rate and intensity of claudin-4 in CCA tissue and matched paracancerous tissue of 77 CCA patients. Correlation of claudin-4 expression in CCA with its clinicopathological characteristics was analyzed, and survival analysis was conducted by using Kaplan-Meier method. Results: Claudin-4 was strongly expressed in CCA tissue and mildly or weakly expressed in matched paracancerous tissue; the immunohistochemical score was significantly higher in cancerous tissue than in paracancerous tissue (9.22±3.62vs. 7.12±4.26,P<0.05). Claudin-4 expression was significantly correlated with tumor location and tumor differentiation (Pall <0.05); the high expression rate was significantly higher in poorly differentiated CCA than in well or moderately differentiated ones (76.2%vs. 50.0%). The 31-month accumulate survival rates of claudin-4 low-expression group and high-expression group were 29.8% and 21.1%, respectively (P>0.05). Conclusions: Claudin-4 is highly expressed in CCA and negatively correlated with tumor differentiation. It might be a novel diagnostic biomarker and therapeutic target for CCA.

作為整合素家族成員之一，claudin-4是細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組分，在正常上皮組織中發(fā)揮固定細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞間通透性的作用。上皮腫瘤中普遍存在claudin-4表達(dá)異常，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[1]，已發(fā)現(xiàn)claudin-4在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[1-6]，并與某些惡性腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)[3,6]。Ryu等[7]的研究顯示，claudin-4在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)率顯著高于肝細(xì)胞癌，是兩者鑒別診斷的獨(dú)立生物學(xué)標(biāo)記物。Bunthot等[8]則發(fā)現(xiàn)，claudin-4在肝吸蟲相關(guān)膽管癌和癌前增生膽管上皮中呈高表達(dá)，敲除claudin-4可抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而亦有研究發(fā)現(xiàn)claudin-4在惡性腫瘤中起抑癌作用，如在卵巢癌細(xì)胞中，claudin-4可抑制EphA2致癌信號通路激活[9]；在胰腺導(dǎo)管腺癌中，claudin-4高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后較好[10]。鑒于claudin-4在惡性腫瘤中的生物學(xué)作用存在爭議且我國目前尚無關(guān)于claudin-4在膽管癌中表達(dá)的研究，本研究通過檢測claudin-4在77例膽管癌及其配對癌旁組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，初步探討claudin-4在膽管癌診斷和治療中的意義。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

收集2013年3月—2014年8月在南京鼓樓醫(yī)院接受膽管癌手術(shù)治療患者的冰凍或石蠟包埋組織標(biāo)本，同時采集患者臨床病理資料，電話隨訪獲取生存信息。入組標(biāo)本HE染色切片由資深病理醫(yī)師再次讀片，與住院期間病理診斷進(jìn)行比對、確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①再次病理讀片確認(rèn)為非膽管癌；②隨訪過程中因“非膽管癌”原因死亡；③術(shù)前接受放療或化療；④臨床病理資料不完整。結(jié)果共77例膽管癌組織及其配對癌旁組織(腫瘤切緣經(jīng)病理證實(shí)的非癌組織)標(biāo)本納入研究，來源病例中男性49例，女性28例，年齡34～79歲，平均(58.8±10.6)歲；腫瘤部位：肝內(nèi)23例，肝門部31例，遠(yuǎn)端23例。生存時間定義為術(shù)后第1 d至因膽管癌死亡或隨訪截止時間(2015年10月)的生存月數(shù)。

二、免疫組化染色

兔抗人claudin-4單克隆抗體為Abcam plc.產(chǎn)品，SP免疫組化檢測試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫靜置10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗3×5 min；檸檬酸熱抗原修復(fù)，PBS漂洗3×5 min；加入正常山羊血清室溫封閉2 h，PBS漂洗2次；加入一抗(1 μg/mL)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3×5 min；加入二抗，室溫孵育30 min，PBS漂洗3×5 min；加入DAB染色液，顯微鏡下觀察，自來水沖洗終止染色；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，由資深病理醫(yī)師讀片。

結(jié)果判斷：采用Formwitz半定量積分法。光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個100倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并觀察染色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞比率：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強(qiáng)度：無色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分?？偡譃閮身?xiàng)評分之積：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)；0～8分為低表達(dá)，9～12分為高表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、Claudin-4在膽管癌組織中表達(dá)上調(diào)

免疫組化染色結(jié)果顯示，膽管癌組織中claudin-4以強(qiáng)陽性表達(dá)為主，癌旁組織以中等和弱陽性表達(dá)為主，陽性表達(dá)主要定位于胞膜和胞質(zhì)(圖1)。癌組織和癌旁組織中claudin-4免疫組化評分分別為9.22±3.62和7.12±4.26，癌組織明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.18，P<0.05)。

二、膽管癌組織中claudin-4表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析顯示，不同部位膽管癌的claudin-4表達(dá)水平差異顯著，肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌高表達(dá)率分別為78.3%、54.8%和39.1%(P<0.05)；此外，claudin-4表達(dá)水平與膽管癌分化程度亦顯著相關(guān)，低分化腺癌高表達(dá)率顯著高于高-中分化腺癌(76.2%對50.0%，P<0.05)；claudin-4表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期和有無血管浸潤均無相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

A(C)：膽管癌細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)claudin-4強(qiáng)陽性表達(dá)；B(D)：癌旁組織claudin-4弱陽性表達(dá)

表1膽管癌組織中claudin-4表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理參數(shù)例數(shù)Claudin-4低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值性別0.2290.632 男492029 女281315年齡0.2140.644 <60歲421725 ≥60歲351619腫瘤部位7.3030.026 肝內(nèi)23518 肝門部311417 遠(yuǎn)端23149腫瘤大小2.0980.147 <7cm3371918 ≥7cm3401426分化程度4.2780.039 高-中分化562828 低分化21516TNM分期0.5630.453 Ⅰ-Ⅱ期572334 Ⅲ-Ⅳ期201010血管浸潤0.3100.578 無512328 有261016

鑒于claudin-4在不同部位膽管癌中的表達(dá)差異，本研究分別分析了其在不同部位膽管癌中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示肝內(nèi)膽管癌中的claudin-4表達(dá)與性別相關(guān)，男性高表達(dá)率顯著高于女性(P=0.033)；肝門部膽管癌中的claudin-4表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)，低分化腺癌高表達(dá)率顯著高于高-中分化腺癌(P=0.021)。

三、膽管癌組織中claudin-4表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

71例患者獲得完整隨訪資料，中位隨訪期23個月(14～31個月)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，claudin-4低表達(dá)組和高表達(dá)組31個月累積生存率分別為29.8%和21.1%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.566，P=0.211)(圖2)。

圖2膽管癌組織中claudin-4表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系(Kaplan-Meier生存曲線)

討　　論

膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，按其發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌，近年其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。由于缺乏特異性診斷指標(biāo)和有效的晚期腫瘤治療方案，膽管癌患者預(yù)后極差，診斷后5年生存率低[11-13]。因此，尋找膽管癌特異性生物學(xué)標(biāo)記物，對于其早期診斷、早期治療和療效提高具有重要意義。Claudin-4為細(xì)胞表面跨膜蛋白，近年對其在上皮腫瘤中作用的研究報(bào)道不斷增多，但涉及膽管癌者尚少。本研究旨在分析claudin-4表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，探討其是否可作為膽管癌診斷和治療的靶點(diǎn)。

既往國外研究[7-8]和本研究均發(fā)現(xiàn)claudin-4在膽管癌組織中呈異常高表達(dá)，提示其可能為膽管癌相關(guān)抗原之一。今后可考慮對行ERCP操作的膽管癌和非膽管癌患者進(jìn)行膽汁claudin-4檢測，觀察是否存在表達(dá)差異，以明確其對膽管癌的診斷意義。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，claudin-4在膽管癌癌旁組織中以中等和弱陽性表達(dá)為主，而Bunthot等[8]發(fā)現(xiàn)claudin-4在正常膽管組織(非癌旁組織)中呈弱陽性而無中等陽性表達(dá)，分析其原因可能為癌旁組織雖保持正常形態(tài)，但癌組織對其細(xì)胞代謝和分子表達(dá)可產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致其claudin-4表達(dá)與正常膽管組織存在差異。本研究分析顯示，膽管癌組織中的claudin-4表達(dá)水平與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示其在膽管腫瘤上皮的分化成熟過程中可能起一定調(diào)節(jié)作用。惡性腫瘤的分化程度一般與患者預(yù)后呈正相關(guān)，由此推測claudin-4高表達(dá)者預(yù)后相對較差，本研究Kaplan-Meier生存曲線分析證實(shí)claudin-4高表達(dá)者31個月累積生存率低于低表達(dá)者(21.1%對29.8%)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與本研究樣本量較小、入組病例臨床分期不均一等因素有關(guān)。今后擬累積樣本量和病例隨訪時間，并選擇臨床分期均一的病例進(jìn)行分析，以期更好地評估claudin-4對膽管癌患者預(yù)后的影響。

Claudin-4為整合素家族成員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透性和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)、肝門部和遠(yuǎn)端膽管癌組織的claudin-4高表達(dá)率呈遞減趨勢，考慮可能與不同部位膽管上皮細(xì)胞的上述功能存在差異，以及不同部位膽管癌在起源、病因和發(fā)病機(jī)制方面本身即存在明顯差異有關(guān)[13]。進(jìn)一步分析claudin-4在不同部位膽管癌中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管癌中其表達(dá)與患者性別相關(guān)，而在肝門部膽管癌中，其表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)，此種差異亦提示claudin-4在不同部位膽管癌中所起的作用可能有所不同，其確切生物學(xué)功能有待后續(xù)累積樣本量作進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)claudin-4在膽管癌中呈異常高表達(dá)，并與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，因此有望成為膽管癌診斷新的生物學(xué)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。有研究[14]將具有claudin-4結(jié)合作用而無毒性的產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素羧基端片段(C-CPE)與具有細(xì)胞毒作用的白喉毒素片段A(DTA)融合，建立了可特異性靶向claudin-4，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒作用的DTA-C-CPE分子，提示了claudin-4用于腫瘤靶向治療的可行性。Claudin-4表達(dá)與膽管癌分化程度呈負(fù)相關(guān)，與患者預(yù)后亦有負(fù)相關(guān)傾向，提示其在膽管癌中總體上起促癌作用，但其在不同部位膽管癌中的生物學(xué)功能及其可能促癌機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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(2015-12-04收稿；2016-01-10修回)

Expression of Claudin-4 in Cholangiocarcinoma and its Clinical Significance

WANG Yun, CHEN Min, CHEN Jun, LI Yunhong, ZHUGE Yuzheng.

Drum Tower Clinical Medical College of Nanjing Medical University, Nanjing (210008)Co-correspondence to: LI Yunhong, Email: 13605156761@163.com; ZHUGE Yuzheng, Email: yuzheng9111963@aliyun.com

Bile Duct Neoplasms;Prognosis;Claudin-4;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.004

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目醫(yī)學(xué)重點(diǎn)科技發(fā)展項(xiàng)目(ZKX11022)；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(YKK12053)；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目杰出青年基金項(xiàng)目(JQX14005)

#Email: 972585606@qq.com

&本文共同通信作者，李運(yùn)紅，Email: 13605156761@163.com；諸葛宇征，Email: yuzheng9111963@aliyun.com