趙春娜　肖麗麗　王　倍　魏玥光

大慶油田總醫(yī)院消化內科(163000)

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慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化水平的研究

趙春娜*肖麗麗王倍魏玥光

大慶油田總醫(yī)院消化內科(163000)

背景：慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種胃黏膜發(fā)生萎縮性改變的慢性胃炎，目前CAG外周血生物標記物的研究較少見。目的：探討CAG患者外周血Runx3基因啟動子區(qū)各CpG位點的甲基化水平。方法：選取2013年6月—2014年5月大慶油田總醫(yī)院82例輕度CAG患者和73例中重度CAG患者，以45名胃黏膜正常者作為對照。采用MALDI-TOF-MS法測定Runx3基因啟動子區(qū)各CpG位點的甲基化水平，熒光定量PCR法測定Runx3 mRNA表達，蛋白質印跡法測定Runx3蛋白表達。結果：與對照組和輕度CAG組相比，中重度CAG組Runx3基因啟動子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點的甲基化水平明顯升高(P<0.05)；Runx3 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)。而輕度CAG組Runx3基因各CpG位點的甲基化水平、Runx3 mRNA和蛋白表達與對照組無明顯差異(P>0.05)。結論：CAG患者外周血Runx3基因啟動子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點的高甲基化可抑制Runx3表達，有望作為CAG臨床分期的生物標記物。

胃炎, 萎縮性；Runx3；甲基化；生物學標記

Background: Chronic atrophic gastritis (CAG) is a kind of chronic gastritis with atrophic changes of gastric mucosa. The studies on peripheral blood biomarkers in CAG are rare. Aims: To investigate the methylation of peripheral blood CpG sites in Runx3 gene promoter region in CAG patients. Methods: Eighty-two mild CAG patients, 73 moderate to severe CAG patients from June 2013 to May 2014 at Daqing Oilfield General Hospital were enrolled, and 45 patients with normal gastric mucosa were served as controls. The methylation of CpG sites in Runx3 gene promoter region was measured by MALDI-TOF-MS. mRNA expression of Runx3 was determined by fluorescent quantitative PCR, and the protein expression of Runx3 was determined by Western blotting. Results: Compared with the control group and mild CAG group, methylation levels of CpG13, CpG14 and CpG15 sites in Runx3 gene promoter region were significantly increased in moderate to severe CAG group (P<0.05), the mRNA and protein expressions of Runx3 were significantly decreased (P<0.05). No significant differences in methylation of CpG sites in Runx3 gene promoter region and mRNA and protein expressions of Runx3 were found between mild CAG group and control group (P>0.05). Conclusions: The hypermethylation of peripheral blood CpG13, CpG14 and CpG15 sites in Runx3 gene promoter region can inhibit the expression of Runx3 in CAG patients, and can be used potentially as the biomarker for clinical staging of CAG.

慢性萎縮性胃炎(CAG)的發(fā)病機制目前尚不清楚，隨著幽門螺桿菌(Hp)感染率的增高、環(huán)境污染加劇以及不健康的生活方式如高脂、高鹽飲食、蔬菜水果攝入不足等問題的凸顯，我國CAG的發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。長期CAG改變可導致胃癌的發(fā)病率增高，CAG為公認的胃癌癌前病變，因此尋找CAG早期非侵襲性生物標記物可能有助于降低胃癌發(fā)病率[3-4]，以達到早期預防和治療的作用。

Runx3是一種重要的抑癌基因，其表達降低可通過影響機體多種蛋白如Smad的功能，導致腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因啟動子區(qū)包含兩個高度保守的CpG島，可調控Runx3基因表達[5]。目前關于CAG患者Runx3基因甲基化水平的研究較少見，且缺乏甲基化CpG位點的分布位置的報道。本研究通過采用MALDI-TOF-MS法測定CAG患者外周血Runx3基因啟動子區(qū)各個CpG位點的甲基化水平，旨在探討其作為CAG生物標記物的可行性，從而為尋找CAG新的治療靶點提供理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

收集2013年6月—2014年5月大慶油田總醫(yī)院消化內科經胃鏡檢查確診為CAG的患者155例。納入標準：①年齡為20～60歲；②首次診斷為CAG。排除標準：①伴有肝腎疾病、糖尿病、心血管疾病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病如過敏性鼻炎、皮炎或哮喘等疾??；②過去一年內長期服用(>3個月)維生素或微量元素補充劑、中藥或其他免疫抑制劑等；③過去一年內曾暴露于醫(yī)療射線或鉻汞補牙；④過去半年內燙染過頭發(fā)或進行過家居裝修；⑤過去半年內曾服用過治療Hp的藥物；⑥有胃癌、結腸癌等消化道腫瘤的家族史。選取同期45名胃鏡檢查黏膜正常者作為對照。本研究的設計方案由大慶油田總醫(yī)院生物醫(yī)學倫理委員會審查通過，所有納入對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 胃鏡檢查：納入者均由同一位內鏡醫(yī)師行胃黏膜取材，根據(jù)病變部位選取五個方位的胃黏膜行活檢。由兩名病理科醫(yī)師進行讀片，如結果不一致，交由第三位經驗更為豐富的病理科醫(yī)師進行最終的判斷。胃黏膜損傷程度分級：輕度：胃竇部淺層腺體呈局灶性萎縮、減少，而大小彎腺體正常；中度：胃竇部和小彎腺體均有萎縮、減少，且范圍較輕度廣泛；重度：胃竇部大部分萎縮、減少，僅殘留少數(shù)原有腺體；大、小彎和彎腺體萎縮；或黏膜顯著變薄，原有腺體完全萎縮、消失，以化生腺體代之。

2. 血樣采集：采集受試者空腹外周靜脈血10 mL，分裝于兩管。EDTA抗凝管6 mL，用于RNA、DNA和蛋白質的提??；抗凝管4 mL，分離血清，用于Hp感染情況的測定。

3. Runx3基因甲基化水平的測定：應用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，并測定其濃度和質量。應用MALDI-TOF-MS法測定Runx3基因啟動子區(qū)各CpG位點的甲基化水平。使用相關數(shù)據(jù)庫(UCSC、Ensamble和NCBI)并結合文獻資料，確定Runx3基因CpG島的序列。采用Sequenom公司在線設計軟件設計Runx3的引物序列，正向：5’-agg aag aga gGT TTT TGG GGA TGT AGG TTT GG-3’，反向：5’-cag taa tac gac tca cta tag gga gaa ggc tAA AAA ACA CTT CAT AAT AAA CCA CC-3’。按DNA甲基化試劑盒(Zymol公司)說明書對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。PCR反應體系總體積為5 μL。反應條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)；72 ℃ 3 min。每個PCR反應體系中加入0.3 μL蝦堿性磷酸酶(SAP)和1.7 μL ddH2O混勻，SAP反應條件：37 ℃ 20 min；85 ℃ 5 min。堿基特異性酶切反應體系總體積為7 μL，37 ℃ 3 h。使用DNA質譜陣列基因分析系統(tǒng)(MassARRAYR)行質譜分析，測定Runx3基因啟動子區(qū)各CpG位點的甲基化水平。

4. Runx3基因mRNA表達的測定：Trizol提取血液mRNA，測定RNA濃度和質量。逆轉錄合成cDNA(試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司)。利用美國Bio-Rad公司CFX-96熒光定量PCR儀行qRT-PCR(SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司)。以β-actin為內參，對所有樣品進行均一化處理，然后與對照組進行比較，以2-△△Ct法計算目的基因mRNA的表達量。

5. Runx3蛋白表達的測定：參照血液總蛋白提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)說明書抽提血液總蛋白，采用蛋白質印跡法測定Runx3蛋白表達。

三、統(tǒng)計學分析

結　　果

一、一般情況

對照組、輕度CAG組和中重度CAG組患者性別、年齡、BMI、Hp感染率、吸煙和飲酒狀況差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)，說明具有可比性。

表1　三組研究對象的基本情況

*吸煙的定義：每天至少吸1支，且持續(xù)至少1年；亦包括戒煙不足1年者；**飲酒的定義：每周不少于3次，每次不少于2兩白酒或1瓶啤酒

二、Runx3基因CpG位點的甲基化水平

與對照組和輕度CAG組相比，中重度CAG組中Runx3基因CpG13、CpG14和CpG15位點的甲基化水平明顯升高(P<0.05)，而輕度CAG組Runx3基因各CpG位點的甲基化水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

三、Runx3 mRNA和蛋白表達

與對照組和輕度CAG組相比，中重度CAG組Runx3 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)，輕度CAG組Runx3 mRNA和蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2、3)。

*與輕度CAG組和對照組比較，P<0.05

圖3　各組Runx3蛋白表達(蛋白質印跡法)

討　　論

多數(shù)疾病的發(fā)生由環(huán)境因素和遺傳因素共同調控[6-7]。CAG的發(fā)生、發(fā)展亦是基因-環(huán)境交互作用的結果，即環(huán)境污染和不健康飲食因素的暴露可通過多種不同途徑影響相關基因的表達，進而導致CAG的發(fā)生。目前研究表明基因的表達受多種因素的調控，其中包括DNA甲基化水平和模式的改變。DNA甲基化是指在甲基轉移酶作用下，以S-腺苷蛋氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉移至特定堿基的過程。其可通過影響染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性和DNA與蛋白質的相互作用，從而調控基因的表達，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起有至關重要的作用。

*與輕度CAG組和對照組比較，P<0.05

Runx3基因為Runx家族成員之一，位于人1號染色體短臂上。目前研究表明Runx3啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化可引起mRNA和蛋白表達的降低或直接導致基因靜默和表達缺失，進而導致多種疾病的發(fā)生，包括肝癌、胃癌等[8-9]，且其甲基化水平可作為這些腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物標記物。近年有研究發(fā)現(xiàn)，Runx3是TGF-β信號轉導通路中的轉錄因子，可通過加強Smad復合物與靶位點的結合并激活靶基因，起調控細胞生長發(fā)育、細胞周期、凋亡和惡性轉化等作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因內含2個高度保守的CpG島，其甲基化水平可通過影響基因表達而導致TGF-β信號轉導通路調節(jié)的紊亂，從而參與多種疾病的發(fā)生，特別是腫瘤，包括胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等[11-14]。

CAG為胃癌的癌前病變，尋找其早期的生物標記物具有一定的臨床意義。Zou等[15]的研究已證實胃癌患者存在Runx3基因的高甲基化改變，且Runx3基因啟動子區(qū)甲基化水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的正相關。本研究發(fā)現(xiàn)中重度CAG患者外周血Runx3基因啟動子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點的甲基化水平超過30%，且均顯著高于胃黏膜正常者(P<0.05)，與前期研究[15]中胃癌組織的變化趨勢相一致。同時中重度CAG患者Runx3 mRNA和蛋白表達明顯低于胃黏膜正常者(P<0.05)，說明Runx3基因高甲基化可影響相應基因的表達，甚至引起蛋白表達的缺失，進而誘導胃黏膜的癌變。

綜上所述，CAG患者外周血Runx3基因啟動子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點的高甲基化可抑制Runx3的表達，進而影響患者的臨床癥狀，上述位點的甲基化有望作為CAG臨床分期的生物標記物。

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(2015-10-08收稿；2015-10-28修回)

Investigation on Methylation of Runx3 Gene in Patients with Chronic Atrophic Gastritis

ZHAO Chunna, XIAO Lili, WANG Bei, WEI Yueguang.

Department of Gastroenterology, Daqing Oilfield General Hospital, Daqing, Heilongjiang Province (163000)

Gastritis, Atrophic;Runx3;Methylation;Biological Markers

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.006

*Email: zjg122@sina.com