孫玉軍，周禮元

1(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽，233100) 2(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 合肥，230601)

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秀珍菇子實體多糖PFP-m的膜法分離及其性質(zhì)研究

孫玉軍1*，周禮元2

1(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽，233100) 2(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 合肥，230601)

以秀珍菇子實體為原料，經(jīng)閃式提取、Sevag法脫蛋白、不同孔徑的濾膜分離，得到秀珍菇子實體多糖(PFP-m)。采用光譜分析和比色等方法對其部分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行測定。結(jié)果表明：PFP-m為均一組分，分子質(zhì)量為3.27×104Da；具有多糖的特征吸收峰；PMP衍生化結(jié)合HPLC法得出其單糖組成及摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖=3.10∶1.00∶22.99∶6.85∶4.59。PFP-m具有多糖的一般理化性質(zhì)，總糖含量為93.16 %。與柱層析法相比，膜超濾法操作簡單，效率高，適合秀珍菇子實體多糖PFP-m的分離純化。

秀珍菇；子實體；多糖；膜分離

多糖是生物體內(nèi)具有重要功能的生物大分子之一，在自然界分布廣泛，主要存在于動物、植物、微生物等機體內(nèi)，具有抗氧化、抗衰老、增強機體免疫[1]、抗腫瘤等功效[2]。

多糖的提取方法有熱水浸提、超聲提取、微波提取、超高壓提取、超臨界提取、酶法提取等，不同的提取方法各有其優(yōu)缺點[3]。閃式提取是近年來發(fā)展起來的一種高效的提取方法，其原理是利用高速機械剪切力和超速動態(tài)分子的滲濾作用，在一定的溫度(如室溫)和溶劑條件下，將植物、食用菌子實體等材料破碎成細微顆粒，使待提成分迅速達到微粒組織的內(nèi)外平衡，能最大限度的保留材料的有效成分，具有速度快、效率高、能耗低等優(yōu)點，適合多糖等活性物質(zhì)的有效提取[4]。

獲得多糖純品，除了去除蛋白、脫色素等除雜外，還需進一步分離純化。近年來，膜過濾法開始用于多糖等生物活性物質(zhì)的分離與純化[5-8]。本文以秀珍菇子實體為材料，采用閃式提取、閃式蒸餾、乙醇沉淀、Sevag法脫蛋白得秀珍菇粗多糖(PFP)，PFP經(jīng)膜超濾技術(shù)獲得均一多糖PFP-m，并通過紅外光譜、紫外光譜、液相色譜等方法對其理化性質(zhì)和部分結(jié)構(gòu)進行測定。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)子實體，由安徽科技學(xué)院食用菌研究所陸曉民教授提供。

標準葡聚糖T3,T10,T40,T70,T100, T200,T500,T2000，瑞典Pharmacia公司；DEAE-Sepharose F.F，瑞典Pharmacia公司；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器與設(shè)備

JHBE-50T閃式提取器，河南智晶生物科技股份有限公司；JMF-320G多級閃蒸器，河南智晶生物科技股份有限公司； AKTA Purifier10 FPLC，GE公司； Masterflex蠕動泵，Cole-Parmer公司；Vivaflow50 超濾膜， Sartorius Stedim Biotech公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機，Eppendorf公司；Nicolet 380紅外光譜儀，Thermo公司；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent1260蒸發(fā)光散射檢測器，Agilent 公司；UltrahydrogelTM1000色譜柱(7.8 mm×300 mm)，Waters公司。

1.3實驗方法

1.3.1秀珍菇粗多糖的閃式提取

秀珍菇子實體粉末200 g，加入7 000 mL蒸餾水，電子轉(zhuǎn)速8 000 r/min，閃式提取器閃式提取2 min，提取液經(jīng)多級閃蒸器濃縮至適當體積，加3倍體積的體積分數(shù)為95%乙醇沉淀12 h，4 500 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)蒸餾水復(fù)溶，離心，上清液冷凍干燥得秀珍菇子實體粗多糖。

1.3.2秀珍菇粗多糖的脫蛋白[9]及HPLC 法[10]檢測

取一定質(zhì)量的秀珍菇粗多糖，用蒸餾水溶解，加入多糖溶液1/4體積的Sevag試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]脫蛋白數(shù)次，直至中間層無蛋白出現(xiàn)，再經(jīng)冷凍干燥得多糖干粉(PFP)。取少許PFP溶于適量的二蒸水中，12 000 r/min離心10 min，上清液再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣量為10 μL，色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTM1000(7.8 mm×300 mm)；流動相為二蒸水，流速為1 mL/min；柱溫35 ℃，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測，根據(jù)HPLC圖譜分析，判斷PFP含有多糖的種類及相應(yīng)的分子質(zhì)量。

1.3.3PFP的超濾膜分離

取PFP溶于適當體積的二蒸水，12 000 r/min離心10 min，過0.22 μm 微孔濾膜，根據(jù)PFP的HPLC圖譜(圖1)可知，第三個峰面積最大，且其保留時間與Dextran T40(分子質(zhì)量40 kDa)相近，因此首先選擇截留分子質(zhì)量50 kDa的超濾膜超濾，跨膜壓力為103.42 kPa，收集濾液；濾液再選擇截留分子質(zhì)量5 kDa的超濾膜超濾，跨膜壓力為103.42 kPa，收集截留液，截留液經(jīng)冷凍干燥，命名為秀珍菇子實體多糖PFP-m。

1.3.4PFP-m的純度鑒定及分子質(zhì)量測定

1.3.4.1純度鑒定

采用HPLC法[10]。

1.3.4.2分子質(zhì)量測定

采用HPLC法[10]。系列標準葡聚糖和樣品PFP-m用二蒸水溶解，12 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣量為20 μL。色譜條件：色譜柱UltrahydrogelTM1000；流動相為二蒸水，流速為1 mL/min；柱溫35 ℃，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測。以保留時間為橫坐標，相對應(yīng)的各標準葡聚糖(Dextran)分子質(zhì)量的對數(shù)值(lgMw)為縱坐標繪制標準曲線，得出分子質(zhì)量標準曲線方程。

1.3.5PFP-m紫外光譜掃描

取適量的PFP-m用適量的二蒸水溶解，于190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.3.6PFP-m紅外光譜掃描

樣品采用KBr壓片，于400～4 000 cm-1掃描。

1.3.7PFP-m的單糖組分測定

采用PMP柱前衍生化法[11]。樣品經(jīng)三氟乙酸(TFA)水解，水解后的樣品和鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)等標準單糖與PMP發(fā)生衍生化反應(yīng)，所得產(chǎn)物采用HPLC法檢測分析。流動相為PBS(50 mmol/L)-乙腈混合物，柱溫25 ℃，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm)，檢測波長245 nm，進樣量20 μL。

1.3.8PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量測定

理化性質(zhì)測定參考文獻[12]進行；總糖含量測定以葡聚糖T40為標準品，采用苯酚-硫酸法[13]。

2　結(jié)果與分析

2.1秀珍菇粗多糖的提取結(jié)果

秀珍菇子實體經(jīng)閃式提取、閃蒸、離心、醇沉、冷凍干燥獲得17.16 g粗多糖，得率為8.58%，比楊潤亞等[14]采用的超聲提取秀珍菇子實體多糖的得率6.19 mg/g(即6.19%)高，且提取時間短，這主要是由于閃式提取伴有高速攪拌、超強振動、負壓滲透等作用實現(xiàn)秀珍菇子實體組織的快速破碎，浸提時間短、提取效率高的緣故。

2.2PFP、PFP-m的HPLC的檢測及膜超濾結(jié)果

PFP、PFP-m的HPLC檢測圖譜如圖1、圖2所示。由圖1可知，PFP含有4種多糖，按照分子質(zhì)量從大到小依次命名為PFP-1、PFP-2、PFP-3、PFP-4，保留時間分別為6.349、7.607、8.794、10.972 min。根據(jù)葡聚糖分子質(zhì)量標準曲線方程 lgMw=8.900 6-0.498 7t(R2=0.998 8)計算出它們的分子質(zhì)量分別為5.42×105、1.28×105、3.27×104、2.7×103Da，因此選擇截留分子質(zhì)量50、5 kDa的超濾膜分離多糖。

圖1　PFP 的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC of PFP

圖2　PFP-m的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC of PFP-m

PFP經(jīng)截留分子質(zhì)量50 kDa的超濾膜超濾，濾液再經(jīng)5 kDa的超濾膜超濾，截留液冷凍干燥得白色絮狀物質(zhì)，即為秀珍菇子實體膜分離多糖PFP-m，得率為73.21%，分子質(zhì)量在5～50 kDa。

由圖2可以看出，PFP-m的液相色譜圖均呈單一狹長對稱峰，表明其純度高，為均一組分。其保留時間和圖1中的第三個峰(PFP-3)的保留時間一致，可判斷PFP-m 和PFP-3為同一種多糖。

2.3PFP-m的紅外光譜分析

PFP-m在190～400 nm掃描發(fā)現(xiàn)，在260、280 nm處均沒有吸收峰，表明PFP-m既不含有蛋白，也不含有核酸。

2.4PFP-m的紅外光譜分析

PFP-m的紅外光譜圖譜見圖3。PFP-m典型吸收峰均在3 425.13、2 931.41、1 637.35、1 403.10、1 145.57、1 035.01 cm-1波數(shù)位置。3 425.13 cm-1吸收峰是由O—H的伸縮振動引起的，2 931.41 cm-1吸收峰是由糖類C—H伸縮振動引起的，它是糖類的特征吸收峰；1 637.35 cm-1吸收峰是由糖類O—H的彎曲振動引起的；1 403.10 cm-1吸收峰是由糖類C—H變角振動引起的；1 035.01 cm-1吸收峰是由吡喃糖環(huán)引起的。紅外光譜表明PFP-m是一種含有吡喃糖苷鍵的多糖。

圖3　PFP-m的紅外掃描圖譜Fig.3　IR spectrum of PFP-m

2.5PFP-m的單糖組成分析

PFP-m的水解物PMP衍生化高效液相色譜圖見圖4。根據(jù)液相色譜的保留時間可判斷PFP-m含有Man、Rha、Glc、Xyl、Ara 5種組分，它們的摩爾比為Man∶Rha∶Glc∶Xyl∶Ara=3.10∶1.00∶22.99∶6.85∶4.59，PFP-m的單糖組分中，葡萄糖含量最高，鼠李糖含量最低。

1-甘露糖；2-鼠李糖；3-葡萄糖；4-半乳糖；5-木糖；6-阿拉伯糖圖4　標準單糖(a)與PFP-m(b)水解物的PMP衍生化液相色譜圖Fig.4　PMP-labeled HPLC spectrum of standard monosaccharides(a) and PFP-m(b)

2.6PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量

PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量的測定結(jié)果見表1。由表1可知PFP-m不是淀粉類物質(zhì)，也不是單糖和多酚類物質(zhì)，而是典型的多糖類物質(zhì)。

表1　PFP-m的一般理化性質(zhì)及總糖含量

3　結(jié)論與討論

目前實驗室中均一多糖的分離純化多采用離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析法，柱層析法操作繁瑣，上樣量少，分離制備的效率低，不能進行大規(guī)模的制備。而膜超濾法操作簡單，分離制備的量大，效率高，適合工廠化生產(chǎn)。但不是所有的多糖都可以采用膜分離法來制備，首先要看目的多糖與其他物質(zhì)的分子質(zhì)量大小差距有沒有合適的膜可供選擇，其次要看被分離的多糖粘性是否大，如果黏性過大，易產(chǎn)生膜污染和膜孔堵塞，引起膜滲透通量下降。因此在膜分離過程中，多糖的濃度不能太大，否則會引起黏性的增加，造成超濾困難。

本文采用閃式提取、閃式蒸餾的方法制備的秀珍菇子實體粗多糖，提取率高，能耗低，制備時間短，效率高，該方法適合秀珍菇子實體多糖的提取。

秀珍菇子實體粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后、采用截留分子量50 kDa和5 kDa的超濾膜分離得到1種秀珍菇子實體多糖PFP-m。經(jīng)測定，PFP-m為一種均一多糖，且含量高，達到73.21 %，該方法適合秀珍菇子實體多糖PFP-m的分離純化。

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Separation of polysaccharide PFP-m fromPleurotusgeesteranusfruit body by ultrafiltration membrane and its property

SUN Yu-jun1*, ZHOU Li-yuan2

1(School of Life Science, Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100, China)2(School of Life Science, AnhuiUniversity, Hefei 230601, China)

A polysaccharide(PFP-m)was obtained from the fruit body ofPleurotusgeesteranusby a sequential processing of flash extraction, deproteinization and separation through different pore ultrafiltration membrane. Its partial properties and structure were studied by spectrographic method and colorimetry. The results showed that PFP-m was a homogeneous polysaccharide. ItsMw was 3.27×104Da. Typical polysaccharide absorption of PFP-m was in its IR spectrum. PFP-m consists of Man, Rha, Glc, Xyl, Ara, in molar ratios of 3.10∶1.00∶22.99∶6.85∶4.59 by PMP-HPLC. PFP-m has general physical and chemical properties of polysaccharide and its total sugar content were 93.16 %. Compared with column chromatography, ultrafiltration membrane method was easier to operate and more efficient. It was suitable for separation and purification of polysaccharide PFP-m frompleurotusgeesteranusfruit body.

Pleurotusgeesteranus; fruit body; polysaccharide; membrane separation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609029

在讀博士，教授(本文通訊作者，E-mail：sunyujun208@163.com)。

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2014A052)；安徽大學(xué)現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心2015年度開放課題(BM2015004)；安徽省高校2016年優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016211)；安徽科技學(xué)院重點學(xué)科項目(AKZDXK2015B02)

2015-11-10，改回日期：2016-02-23