王強(qiáng)，李旭，竇少華，張慶芳，魏計(jì)東，金連豆，遲乃玉*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，遼寧大連116025）

海洋葡甘聚糖酶菌株的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

王強(qiáng)1，2，李旭3，竇少華1，2，張慶芳1，2，魏計(jì)東1，2，金連豆1，2，遲乃玉1，2*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，遼寧大連116025）

以海泥和海水為樣品，采用稀釋涂布平板法初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到一株葡甘聚糖酶高產(chǎn)菌Q1，測得酶活為187.68 U/mL。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定菌株Q1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其所產(chǎn)酶最適作用溫度為35℃，熱穩(wěn)定性較差；最適作用pH值為6.0，堿性條件下，pH穩(wěn)定性較差；Cu2+、Fe2+、乙二胺四乙酸（EDTA）對該酶抑制性較強(qiáng)，Mg2+對該酶抑制性較弱，NH4+對該酶的活性影響不明顯，Na+對該酶激活作用較弱，Mn2+對該酶激活作用較強(qiáng)。該酶只在外源誘導(dǎo)物存在時(shí)，才能大量合成，說明該酶是誘導(dǎo)酶。

海洋；葡甘聚糖酶；鑒定；枯草芽孢桿菌；酶學(xué)性質(zhì)

葡甘聚糖酶（glucomannanase）是一種能將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖的外泌酶。葡甘低聚糖屬于功能性低聚糖，功能性低聚糖因其具有獨(dú)特的生理功能而受到廣泛關(guān)注［1-2］。葡甘低聚糖具有極其顯著的降脂作用，可以作為高血脂、糖尿病輔助治療產(chǎn)品［3-5］；能提高體內(nèi)超氧化物岐化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力［6］；具有排毒和增強(qiáng)免疫功能的作用［7］；促進(jìn)腸道內(nèi)有益微生物的生長，特別是耐氧雙歧桿菌的生長［8］。獲得葡甘低聚糖的方法主要有：從魔芋中提取，但是工藝復(fù)雜且產(chǎn)率極低；通過人工化學(xué)合成，但步驟繁瑣，成本太高；利用酸水解葡甘聚糖，但這樣生產(chǎn)的低聚糖性質(zhì)不穩(wěn)定，副產(chǎn)品多；利用物理方法降解，但是實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求太高，無法用于大量生產(chǎn)［9］；酶解葡甘聚糖，反應(yīng)效率高且方法簡單，后期分離也容易［10］。目前有關(guān)葡甘低聚糖產(chǎn)品，只有少量出現(xiàn)在國外市場，國內(nèi)基本無此類產(chǎn)品［11］。

海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫葡甘聚糖酶與中高溫葡甘聚糖酶相比具有很大優(yōu)勢，低溫葡甘聚糖酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用。本實(shí)驗(yàn)從海洋樣品中分離篩選出一株葡甘聚糖酶產(chǎn)生菌Q1，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，進(jìn)而確定其種屬，并研究其產(chǎn)生的葡甘聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，為研究海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡甘聚糖酶奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

試驗(yàn)菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Q1篩選自黃海海域（123.396°E，36.7014°N）海水和海泥樣品，現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，魔芋粉0.5%，瓊脂2%，剛果紅適量，pH7.0，121℃滅菌20min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，魔芋粉0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

保藏培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑

魔芋粉：大連凱美化工工程配套有限公司；葡甘聚糖：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；核酸Marker：加拿大Fermentas MBI公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HD-1360超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL-204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；A200型基因擴(kuò)增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀：北京榮陽經(jīng)典科技有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分離鑒定

（1）初篩

取10 mL海水和10 g海泥分別加入90 mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩30 min。用無菌水從10-1依次梯度稀釋至10-8，分別取10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度樣品各0.1 mL，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍有無透明圈，篩選透明圈大的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（2）復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種到裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為一級種子液；

將一級種子液以5%接種量接種到裝液量為100 mL/ 250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為二級種子液。

將二級種子液以5%接種量接種到裝液量為100 mL/ 250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。通過3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定發(fā)酵液酶活，篩選出酶活高的菌株。

（3）形態(tài)學(xué)特征

在初篩培養(yǎng)基上觀察菌落的形狀、顏色等形態(tài)學(xué)特征，通過革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡（10×100）下觀察菌體形態(tài)。

（4）生理生化特征

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第8版）［12］相關(guān)內(nèi)容，對該菌株進(jìn)行淀粉水解、明膠液化、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)。

（5）菌株16S rDNA序列分析

采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。以提取到的菌株Q1 DNA為模板，以16S rDNA基因通用引物對16S rDNA序列片段進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（poly merase chain reaction，PCR）。其引物如下：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴(kuò)增反應(yīng)體系模板（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5 mmol/L）1 μL，Taq酶0.2 μL，正向引物27F（10 μmol/L）0.5 μL，反向引物1492R（10 μmol/L）0.5 μL，補(bǔ)加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃、4 min；94℃、45s，55℃、45s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)；72℃、10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物有限公司測序，將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)基本局部比對搜索工具（basic lacal aliqnment search tood，BLAST）序列比對，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2葡甘聚糖酶酶活測定

DNS法測葡甘聚糖酶酶活［13］：0.9 mL 0.4%葡甘聚糖底物中，加入適當(dāng)稀釋的葡甘聚糖酶酶液0.1 mL，30℃水浴10 min，立即放入100℃水浴5 min，終止反應(yīng)，然后加入2.0mLDNS，100℃顯色5min，冷卻至室溫用蒸餾水定容至20 mL，于波長540 nm處測定吸光度值，根據(jù)酶活公式計(jì)算酶活。葡甘聚糖酶活單位定義：在上述反應(yīng)條件下，葡甘聚糖每分鐘釋放1 μmol甘露糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U）［14-15］。相對酶活以同組最高酶活為100%。

1.3.3粗酶液的制備

將二級種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min、4℃離心20 min，所得上清液即為粗酶液。

1.3.4酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）酶最適作用溫度

取一定量酶液，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下，測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別置于35℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴中，分別保存10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，立即冷卻，并測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（3）酶最適作用pH

在酶最適作用溫度下，分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系中測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（4）酶的pH穩(wěn)定性

將酶液分別置于pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0磷酸鉀緩沖液中，分別保存10min、20min、30min、40min、50min、60min，測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（5）金屬離子與EDTA對酶活影響

在酶最適作用條件下，加入Cu2+、Mg2+、Fe2+、NH4+、Na+、Mn2+及乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使各反應(yīng)體系中金屬離子終濃度為10 mmol/L，測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（6）判斷葡甘聚糖酶是否為誘導(dǎo)酶

第一步：將菌株Q1接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160r/min培養(yǎng)55 h，將發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液測定酶活。

第二步：收集發(fā)酵液中離心菌體，用磷酸鉀緩沖液懸浮菌體，6 000 r/min，4℃離心5 min，收集菌體，再次用磷酸鉀緩沖液將菌體懸浮，重復(fù)3次，將洗好菌體接種到種子培養(yǎng)基（無葡甘聚糖類物質(zhì)）中，26℃、160 r/min培養(yǎng)55 h，將種子液經(jīng)6 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液測定酶活。

第三步：收集種子液中離心菌體，用磷酸鉀緩沖液懸浮菌體，6 000 r/min、4℃離心5 min，收集菌體，再次用磷酸鉀緩沖液將菌體懸浮，重復(fù)3次，將洗好菌體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160 r/min培養(yǎng)55 h，將發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液測定酶活。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

對黃海海域海水和海泥樣品進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到10株具有葡甘聚糖酶活性的菌株，其酶活如表1所示。

表1　菌株產(chǎn)酶活性比較Table 1 Comparison of enzyme activity produced by strains

由表1可知，葡甘聚糖酶酶活最高的是菌株Q1，酶活為187.68 U/mL，與國內(nèi)一些研究報(bào)道相比，菌株Q1所產(chǎn)葡甘聚糖酶酶活高于董桂清［16］報(bào)道的菌株DK3所產(chǎn)酶酶活58.54 U/mL、吳華偉等［17］報(bào)道的菌株MAN所產(chǎn)酶酶活101 U/mL、程愛芳等［18］報(bào)道的菌株HD-1所產(chǎn)酶酶活72.6 U/mL。利用甘油保藏法將菌株Q1保藏于-20℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2菌株Q1形態(tài)學(xué)特征

菌株Q1的菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果見圖1。由圖1A可知，菌株Q1菌落邊緣不規(guī)則，乳白色，不透明，表面干燥，呈褶皺狀，用接種環(huán)易于挑取。由圖1B可知，菌株Q1為革蘭氏陽性菌，桿狀，菌體兩端生有芽孢。

圖1　菌株Q1菌落形態(tài)（A）及顯微形態(tài)（B）Fig.1 Colonial morphology（A）and microscopic morphology（B）of strain Q1

2.3生理生化特征

按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第8版）對菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2　菌株Q1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain Q1

由表2可知，菌株Q1生理生化特征為：淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，脲酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。由生理生化試驗(yàn)結(jié)果可初步鑒定其為芽孢桿菌屬。

2.416S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

選擇產(chǎn)葡甘聚糖酶酶活最高的菌株Q1進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將得到的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為1 486 bp。

以菌株Q1的16SrDNA序列為基基，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性最高的己知分類菌株序列進(jìn)行比較，以軟件構(gòu)建菌株Q1系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。由圖3可知，菌株Q1與枯草芽孢桿菌同源性最高為100%，因此可以鑒定菌株Q1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2　菌株Q1 16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification products electrophoresis of 16S rDNA ofstrain Q1

圖3　菌株Q1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Q1 based on 16S rDNA sequence

2.5酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1酶最適作用溫度

由圖4可知，酶的最適作用溫度為35℃，40℃以后酶活迅速下降，在20～35℃下酶活能保持在80%以上，這符合低溫酶的特性。在低溫條件下，相對嗜溫型酶而言，低溫酶反應(yīng)所需時(shí)間更短，這是低溫酶的應(yīng)用優(yōu)勢［19］。

圖4　葡甘聚糖酶最適作用溫度Fig.4 The optimum temperature of the glucomannanase

2.5.2酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，該葡甘聚糖酶熱穩(wěn)定性比較差，經(jīng)60℃處理30 min，酶活不足20%，70℃處理30 min，酶活不足10%。原因可能是低溫酶結(jié)構(gòu)的高度柔順性可能造成蛋白的離子配位松散，并且由于缺乏二硫鍵及剛性的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致低溫酶對熱變性和化學(xué)變性敏感，穩(wěn)定性降低［20］。

圖5　葡甘聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 The thermostability of the glucomannanase

2.5.3酶最適作用pH

在同一溫度下，不同的pH對于相對酶活會產(chǎn)生不同的影響。由圖6可知，該葡甘聚糖酶最適反應(yīng)pH為6.0，pH值為5.0～6.0時(shí)，葡甘聚糖酶相對酶活均在80%以上，pH值為7.0～11.0時(shí)，相對酶活呈下降趨勢；pH達(dá)到11.0時(shí)，相對酶活幾乎為零。

圖6　葡甘聚糖酶最適作用pHFig.6 The optimum pH of glucomannanase

2.5.4酶的pH穩(wěn)定性

由圖7可知，該葡甘聚糖酶最適作用pH為6.0，經(jīng)pH 5.0處理30 min，相對酶活仍為80%以上；pH 8.0處理30 min，相對酶活僅為20%；pH 9.0處理30 min，相對酶活不足10%，故該酶具有一定耐酸性，堿性條件下，pH穩(wěn)定性較差，這是由于酶分子中所含的酸性氨基酸比率偏高導(dǎo)致的。

圖7　葡甘聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of the glucomannanase

2.5.5金屬離子和EDTA對酶活的影響

由表3可知，Cu2+、Fe2+、EDTA對酶的抑制性較強(qiáng)，Mg2+對酶的抑制性較弱，NH4+對酶作用不明顯，Na+對酶有較弱的激活作用，Mn2+對酶有較強(qiáng)的激活作用。該酶能被EDTA強(qiáng)烈抑制，可以推測該酶的活性中心構(gòu)象的維持與金屬離子有關(guān)［21］。

表3　金屬離子與EDTA對葡甘聚糖酶活性的影響Table 3 Effects of metal ions and EDTA on the activity of glucomannanase

2.5.6判斷葡甘聚糖酶是否為誘導(dǎo)酶

在沒有外源誘導(dǎo)物（葡甘聚糖類物質(zhì)）時(shí)，沒有葡甘聚糖酶合成，即在種子液中檢測不到葡甘聚糖酶活性，只有在以葡甘聚糖類物質(zhì)為唯一碳源時(shí)，葡甘聚糖酶大量合成，即在發(fā)酵液中測得葡甘聚糖酶活性，說明該酶為誘導(dǎo)酶。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)是從黃海海域的海泥和海水樣品中，初篩得到10株葡甘聚糖酶菌株，DNS法測定酶活進(jìn)行復(fù)篩，得到一株酶活較高的菌株Q1，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16SrDNA序列分析，鑒定菌株Q1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。對其所產(chǎn)的葡甘聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，該酶的最適作用溫度為35℃，酶的熱穩(wěn)定性較差，屬于低溫酶類；酶的最適作用pH為6.0，該酶在堿性條件下穩(wěn)定性較差；Cu2+、Fe2+、EDTA對酶的抑制性較強(qiáng)，Mg2+對酶的抑制性較弱，NH4+對酶作用不明顯，Na+對酶有較弱的激活作用，Mn2+對酶有較強(qiáng)的激活作用；葡甘聚糖酶只在以葡甘聚糖類物質(zhì)為唯一碳源的條件下才能合成，說明該酶為誘導(dǎo)酶。

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WANG Qiang1，2，LI Xu3，DOU Shaohua1，2，ZHANG Qingfang1，2，WEI Jidong1，2，JIN Liandou1，2，CHI Naiyu1，2*
（1.College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center，Dalian 116622，China；3.Dalian Productivity Promote Center，Dalian 116025，China）

Using sea mud and seawater as samples，a high glucomannanase-producing strain Q1 was obtained by spread plate method preliminary screening and shake flask fermentation secondary screening，and the enzyme activity was 187.68 U/ml.The strain Q1 was identified asBacillus subtilisby morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The optimum temperature of glucomannanase production was 35℃and the thermostability was weaker.The optimum pH was 6.0，pH stability was weaker in alkaline condition.The glucomannanase activity was strongly inhibited by Cu2+、Fe2+and EDTA，slightly inhibited by Mg2+.The effect of NH4+on the glucomannanase activity was not obvious.The glucomannanase activity was slightly activated by Na+，strongly activated by Mn2+.Only in the exogenous inducer condition，the glucomannanase could be synthesized in quantity，which indicated that the glucomannanase was inducible enzyme.

marine；glucomannanase；identification；Bacillus subtilis；enzymatic properties

Q93

0254-5071（2016）06-0065-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.014

2016-04-01

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’項(xiàng)目（2007AA021306）

王強(qiáng)（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锩钢苿┭芯俊?/p>

遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锩钢苿┭芯俊?/p>