周開升，朱彥東，趙鑫，郭永強(qiáng)，寇江力，汪靜，李森，龍?jiān)谠?，伍亞民，張海?/p>

Ski在 大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間的表達(dá)變化①

周開升1，2，朱彥東1，2，趙鑫1，2，郭永強(qiáng)1，2，寇江力1，2，汪靜2，李森3，龍?jiān)谠?，伍亞民3，張海鴻1

目的探究ski在大鼠正常及損傷后脊髓中的表達(dá)及隨時(shí)間變化的規(guī)律。方法60只成年雌性Sprague-Daw ley大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=30）和損傷組（n=30），各組設(shè)1周、2周、4周、8周、12周亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。用Allen法制備T10打擊損傷模型。損傷后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周行BBB后肢功能評(píng)分；術(shù)后1周、2周、4周、8周、12周，各組取3只大鼠行HE染色，觀察損傷后脊髓病理變化及空洞形成；另3只大鼠行ski免疫熒光染色及半定量分析。結(jié)果損傷組各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分均低于假手術(shù)組（P＜0.05）。損傷后1周、2周，脊髓主要以壞死為主；4周時(shí)空洞完全形成，空洞周圍有致密瘢痕組織；8周、12周空洞及瘢痕無明顯變化，但損傷中心及附近脊髓明顯變細(xì)。ski在正常脊髓中表達(dá)較低，損傷后ski表達(dá)逐漸增高，8周時(shí)達(dá)到高峰，12周時(shí)有所降低；ski在正常及損傷后12周脊髓中主要分布于白質(zhì)；損傷后2周、4周和8周時(shí)灰質(zhì)中出現(xiàn)明確ski表達(dá)。在損傷中心，ski在空洞周圍密集表達(dá)。結(jié)論ski在脊髓損傷后表達(dá)。它可能作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，并調(diào)控其活化、增生以及膠質(zhì)瘢痕形成。

脊髓損傷；ski；星形膠質(zhì)細(xì)胞；瘢痕；大鼠

［本文著錄格式］周開升，朱彥東，趙鑫，等.Ski在大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間的表達(dá)變化［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（9）:1015-1019.

CITED AS:Zhou KS，Zhu YD，Zhao X，etal.Expression and change of skiafter spinal cord injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（9）:1015-1019.

脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)一直是醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，迄今尚未取得突破性進(jìn)展。原癌基因ski及其編碼的蛋白作為一種細(xì)胞類型特異性的多功能分子，在腫瘤發(fā)生、創(chuàng)傷愈合、肝臟再生等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用［1］。相關(guān)研究證實(shí)，ski在胚胎神經(jīng)發(fā)育和部分中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)病理生理過程中也扮演著重要角色［2-5］；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Wnt/β-catenin等多種信號(hào)通路是其發(fā)揮調(diào)控作用的主要途徑［2，6-7］；脊髓損傷后一系列病理生理變化也與這些信號(hào)通路密切相關(guān)。我們推測(cè)，ski可能在脊髓損傷過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

60只成年雌性Sprague-Daw ley大鼠，體質(zhì)量200 g左右，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前1周，飼養(yǎng)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)室，自然晝夜采光，自由飲食、水，保持室溫25～28℃。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。動(dòng)物編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組和損傷組，每組30只。每組再分為1周、2周、4周、8周、12周五個(gè)亞組。

1.2主要儀器和試劑

RM 2007 A llen打擊器：美國(guó)新澤西州大學(xué)。CM 1900冰凍切片機(jī)、SP-2激光共聚焦顯微鏡：LEICA公司。無毒環(huán)保蘇木素-伊紅（HE）染液：南京建成科技有限公司。ski（H-329，sc-9140）：SANTA CRUZ。Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L，ZF-0511）：北京中杉金橋。Image J1.50i圖像分析軟件：National Institutesof Health。

1.3模型建立

大鼠術(shù)前禁食12 h。1%戊巴比妥鈉4m l/kg腹腔注射麻醉，角膜反射消失表明麻醉成功。俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剃去背部皮毛，碘伏及酒精術(shù)區(qū)皮膚消毒。定位T10，以T10為中心背部正中切口，長(zhǎng)約2 cm，鈍性分離棘突及椎旁肌肉，咬開T9-11椎板，顯露脊髓（未損傷硬脊膜）。用A llen打擊器打擊T10脊髓，打擊強(qiáng)度10 g×25mm，打擊后立即移開打擊棒。打擊成功標(biāo)志：打擊后大鼠后肢發(fā)生不同程度抽搐之后癱軟，尾巴發(fā)生痙攣性擺動(dòng)。

假手術(shù)組僅咬開椎板，不打擊。

逐層縫合肌肉和皮膚，放回籠中，置25～28℃動(dòng)物房?jī)?nèi)。術(shù)后予青霉素16萬U肌肉注射，連續(xù)3 d；每天擠壓膀胱協(xié)助排尿3次，直至恢復(fù)自主排尿。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1行為學(xué)評(píng)分

分別于造模后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周時(shí)，采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分法評(píng)估大鼠后肢行為學(xué)功能。1 d、3 d評(píng)分時(shí)，偏離平均值2分以上者視為造模失敗，予以剔除，重新造模補(bǔ)充。評(píng)分由2名熟悉BBB評(píng)分方法的非本組實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行，將大鼠逐一放入曠場(chǎng)內(nèi)，觀察其活動(dòng)4min，評(píng)估其后肢功能。

1.4.2HE染色

造模后1周、2周、4周、8周、12周時(shí)，每亞組各取3只動(dòng)物，0.01mol/L PBS左心室快速灌注，至右心耳流出清亮液體后，改用4%多聚甲醛灌注固定。取出脊髓組織，4%多聚甲醛固定24 h。30%蔗糖PBS溶液充分脫水至沉糖，以損傷為中心、上下各3～4mm，截取長(zhǎng)約6～8mm脊髓組織，OCT冰凍切片包埋劑包埋，縱行連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.4.3免疫熒光染色

各亞組另3只大鼠，取脊髓，經(jīng)上述方法處理后，連續(xù)冰凍橫切片，行免疫熒光單標(biāo)ski染色。0.01 mol/L PBS沖洗5 min，共3次；0.3%Triton X-100破膜25min，0.01mol/L PBS沖洗5min，共3次；10%正常山羊封閉血清封閉30 min，甩干后不洗，滴加ski一抗（1∶50），4℃冰箱過夜；自然復(fù)溫至室溫，0.01 mol/L PBS沖洗5 min，共3次（避光操作），滴加山羊抗兔A lex fluor488（1∶200），37℃烤箱孵育1 h，0.01mol/L PBS沖洗5min，共3次；DAPI染核2min，0.01mol/L PBS沖洗5min，共3次；晾干后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

盡量選取離損傷中心同樣距離的組織切片，激光共聚焦顯微鏡下掃描拍照時(shí)全程以同樣參數(shù)掃描，掃描過程中除可調(diào)整焦距以外，其他參數(shù)均保持不變，選取同一部位、同一視野熒光照片，Image J 1.50i軟件分析，計(jì)算平均光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。BBB評(píng)分、平均光密度值均用（xˉ±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1一般情況

損傷組大鼠術(shù)后蘇醒，精神狀態(tài)較差，雙側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能完全喪失，并開始出現(xiàn)尿潴留；術(shù)后1周內(nèi)，部分大鼠出現(xiàn)血尿和腹部脹氣，之后逐漸恢復(fù)，10 d左右基本恢復(fù)自主排尿。假手術(shù)組大鼠術(shù)后蘇醒即可有部分運(yùn)動(dòng)，基本無后肢功能障礙，無尿潴留及血尿，無明顯腹部脹氣，但術(shù)后3 d內(nèi)部分大鼠有脊柱不穩(wěn)，3 d后運(yùn)動(dòng)功能基本恢復(fù)正常。

2.2BBB評(píng)分

損傷組大鼠3 d內(nèi)評(píng)分均為0～1分；術(shù)后1周內(nèi)后肢功能恢復(fù)較慢，1～4周功能恢復(fù)較為迅速，4～12周功能恢復(fù)速度再次放緩。假手術(shù)組術(shù)后1～3 d部分大鼠可有尾巴下垂或損傷部位脊柱不穩(wěn)現(xiàn)象，3 d后基本恢復(fù)。損傷組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均低于假手術(shù)組（P＜0.05）。見圖1。

圖1　術(shù)后兩組各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較

2.3HE染色

假手術(shù)組脊髓整體結(jié)構(gòu)完整，無損傷及壞死，細(xì)胞排列有序，胞核形態(tài)清晰。

損傷組打擊1周后，損傷中心逐漸出現(xiàn)組織壞死，開始出現(xiàn)較小壞死空洞，損傷周圍胞核密集；2周時(shí)，壞死區(qū)域繼續(xù)擴(kuò)大，損傷中心組織壞死嚴(yán)重，空洞逐步增大；4周時(shí)，壞死組織逐漸減少，空洞完全形成，空洞周圍細(xì)胞增生、胞核排列密集，圍繞空洞形成致密瘢痕組織；8周時(shí)，損傷部位脊髓開始萎縮變細(xì)，空洞基本穩(wěn)定，局部可見纖維組織長(zhǎng)入空洞，形成致密條索，空洞周圍有明顯的瘢痕形成；12周時(shí)，損傷部位及附近脊髓明顯變細(xì)，空洞無明顯變化，空洞周圍瘢痕穩(wěn)定。見圖2。

圖2　假手術(shù)組及損傷各亞組脊髓縱切（HE染色，bar=500μm）

2.4免疫熒光染色

損傷中心上端、位置相對(duì)統(tǒng)一、組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整的切片中，ski在假手術(shù)組及損傷各亞組均有表達(dá)。假手術(shù)組中，ski表達(dá)較弱，分布均勻，主要位于白質(zhì)，灰質(zhì)中無明顯表達(dá)。損傷組1周和2周時(shí)，ski表達(dá)較假手術(shù)組有所增強(qiáng)，且灰質(zhì)中出現(xiàn)明顯表達(dá)；4周和8周時(shí)，灰質(zhì)及白質(zhì)中ski表達(dá)明顯增加；12周時(shí)，ski表達(dá)較4周、8周時(shí)有所下降，灰質(zhì)中表達(dá)信號(hào)再次減少。

與假手術(shù)組比較，打擊后1周，ski表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）；2～12周時(shí)ski表達(dá)顯著增高（P＜0.001），表達(dá)量在8周時(shí)達(dá)到高峰。見圖3、圖4。

圖3　假手術(shù)組及損傷各亞組ski表達(dá)平均光密度值

圖4　假手術(shù)組及損傷各亞組脊髓上端ski表達(dá)（免疫熒光染色，200×）

選擇ski表達(dá)與假手術(shù)組有顯著性差異的2周、4周、8周、12周四個(gè)損傷亞組損傷中心組織切片，不同時(shí)間點(diǎn)，ski均在損傷空洞周圍密集表達(dá)；其中，4周、8周、12周時(shí)，ski在空洞周圍形成一圈致密的高表達(dá)帶；空洞周圍陽性細(xì)胞與空洞遠(yuǎn)端陽性細(xì)胞相比，細(xì)胞體積明顯增大。見圖5。

圖5　損傷部分亞組脊髓損傷中心ski表達(dá)（免疫熒光染色，200×）

3　討論

脊髓損傷后神經(jīng)功能的康復(fù)依然是醫(yī)學(xué)所面臨的重大挑戰(zhàn)。脊髓損傷后一系列病理變化的深入研究及新的分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)依然被視為解開這一難題的關(guān)鍵。

ski作為一種進(jìn)化保守蛋白，在不同物種中廣泛參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖及分化過程［2］。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ski不但可以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育［3］，而且在施萬細(xì)胞增殖、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等一些神經(jīng)系統(tǒng)病理變化中發(fā)揮重要作用［4-5］。

本研究顯示，ski在正常脊髓組織中處于持續(xù)低表達(dá)狀態(tài)；脊髓損傷后ski表達(dá)逐漸增高，8周時(shí)達(dá)到頂峰，12周時(shí)稍有降低。病理觀察發(fā)現(xiàn)，從第4周開始，空洞周圍有明顯致密瘢痕組織形成；8～12周時(shí)，瘢痕組織基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，無明顯變化；與既往研究基本相符［8］。ski表達(dá)與脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成有一定相關(guān)性。

在損傷中心，ski在空洞周圍形成密集的高表達(dá)帶，4周、8周及12周時(shí)，這種現(xiàn)象尤為明顯。ski的分布與膠質(zhì)瘢痕形成高度吻合。我們推測(cè)，ski可能與膠質(zhì)瘢痕的形成有關(guān)。

有研究表明，脊髓損傷可刺激神經(jīng)前體細(xì)胞（如室管膜區(qū)細(xì)胞等）分化為活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而形成膠質(zhì)瘢痕［9］。本研究顯示，ski在正常脊髓中主要表達(dá)于白質(zhì)，灰質(zhì)中基本不表達(dá)；損傷后，灰質(zhì)中開始出現(xiàn)ski，12周時(shí)ski在灰質(zhì)中的表達(dá)再次減少。相關(guān)研究證實(shí)，室管膜區(qū)及室管膜下區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞在脊髓損傷后1周時(shí)可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，并從位于灰質(zhì)的中央管周圍向損傷周圍遷移聚集，最終形成膠質(zhì)瘢痕；在瘢痕形成穩(wěn)定后逐步消失［8］。這與我們發(fā)現(xiàn)的ski在不同時(shí)期灰質(zhì)與白質(zhì)中的表達(dá)變化規(guī)律基本吻合，但是兩者的明確關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

活化的星型膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增生，并向損傷部位遷移聚集，是膠質(zhì)瘢痕形成的重要過程［10］。近年來，關(guān)于膠質(zhì)瘢痕是否有利于神經(jīng)損傷的修復(fù)一直存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，膠質(zhì)瘢痕既是一種質(zhì)密的物理屏障，也分泌一些細(xì)胞因子，共同抑制神經(jīng)修復(fù)過程中的軸突再生和突觸形成［11-13］；也有研究者提出，膠質(zhì)瘢痕可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散，保護(hù)神經(jīng)組織免受創(chuàng)傷后的次級(jí)損傷［10，14］。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生與膠質(zhì)瘢痕形成機(jī)制的研究是至關(guān)重要的課題。

從ski表達(dá)陽性細(xì)胞的形態(tài)及變化分布規(guī)律來看，ski極有可能表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，且在活化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯增多。結(jié)合ski表達(dá)與脊髓損傷后病理變化的相關(guān)性，以及ski在空洞周圍形成致密的高表達(dá)帶的現(xiàn)象，我們推測(cè)，ski可能作為一種新的信號(hào)分子，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、增生等過程，并且可能以此調(diào)控膠質(zhì)瘢痕的形成。這一假設(shè)需要ski表達(dá)的細(xì)胞定位證據(jù)及后續(xù)的研究進(jìn)一步證明。

綜上所述，本研究首次明確ski在脊髓損傷后的表達(dá)變化及分布規(guī)律，結(jié)合已被證實(shí)的膠質(zhì)瘢痕形成規(guī)律，我們推測(cè)，ski可能是一種作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞并調(diào)控其活化、增生以及膠質(zhì)瘢痕形成的信號(hào)分子。

［1］周開升，朱彥東，張海鴻，等.Ski在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:797-800.

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Expression and Changeof Skiafter SpinalCord Injury in Rats

ZHOU Kai-sheng1，2，ZHU Yan-dong1，2，ZHAO Xin1，2，GUO Yong-qiang1，2，KOU Jiang-li1，2，WANG Jing1，2，LISen3，LONG Zai-yun3，WU Ya-min3，ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics，Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou，Gansu 730030，China；2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province，Lanzhou，Gansu 730030，China；3.State Key Laboratory of Trauma，Burns and Combined Injury，the Third Departmentof Research Institute of Surgery，Daping Hospital，Third Military MedicalUniversity，Chongqing 400042，China

ZHANG Hai-Hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

Objective To explore the expression and the changes of skiwith time in the injured spinal cord in rats.Methods Sixty adult female Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham group（n=30）and injury group（n=30），each group were further divided into 1 week，2weeks，4weeks，8weeksand 12weekssubgroups，with 6 rats in each subgroup.Spinal cord injury at T10wasestablished withmodified A llen's technique（10 g×25mm）in the injury group.The hindlimbs behavior of rats was rated with Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）scores 1 day，3 days，1 week，2 weeks，4 weeks，8 weeks and 12 weeks after spinal cord injury.Three rats in each subgroup were stained with HE staining to observe the pathological changesof the spinal cord and the formation of cavity.The other 3 ratswere analyzed with immunofluorescence staining of skiand semiquantitative analysis.Results The BBB scores of each time pointwere less in the injury group than in the sham group（P＜0.05）.Necrosiswas themajor pathological change in the injury groups 1 and 2 weeks after injury；cystic cavity completely formed 4 weeks after injury，with dense scar tissue around it；there was no significant change in the cavity and scar 8 and 12 weeks after injury，however，the adjacent spinal cord was obviously thinner.Ski expressed little in the normal spinal cord，and expressed more andmore after injury，peaked at8weeksand decreased then.Skiwasmainly observed inwhitematter in the sham group and 12weeks injury subgroup，which was in gray matter 2，4 and 8 weeks after injury.Skiwas highly expressed around the cavity in injury center and formed high expression band.Conclusion Skiexpressesafter spinal cord injury in rats，thatmay be associated with the activation and proliferation of astrocytesand the formation of glialscar.

spinal cord injury；ski；astrocyte；scar；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.09.006

R651.2

A

1006-9771（2016）09-1015-05

2016-06-02

2016-06-13）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.30772299）。

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030；3.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400042。作者簡(jiǎn)介：周開升（1990-），男，漢族，甘肅武威市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓損傷。通訊作者：張海鴻，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。