景泉凱，賽音朝克圖，姚海江，呂威，奧村悠斗，楊利娟，劉俊彤，李志剛

·基礎(chǔ)研究·

電針對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬磷酸二酯酶4及其亞型表達(dá)的影響①

景泉凱1，賽音朝克圖2，姚海江3，4，呂威1，奧村悠斗1，楊利娟1，劉俊彤1，李志剛1

目的探討電針治療抑郁癥的生物學(xué)機(jī)制。方法成年雄性Sprague-Daw ley大鼠32只隨機(jī)分為空白組（n=8）、模型組（n=8）、電針組（n=8）、氟西汀組（n=8），采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)的方式建立抑郁模型。開野試驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化。RT-PCR法檢測大鼠海馬磷酸二酯酶4（PDE4）A、PDE4D表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠開野試驗(yàn)水平運(yùn)動次數(shù)和垂直運(yùn)動次數(shù)較空白組顯著降低（P＜0.001），電針組和氟西汀組較模型組顯著增加（P＜0.001）。PDE4A、PDE4DmRNA表達(dá)，電針組比模型組顯著減少（P＜0.001）。結(jié)論抑制PDE4A、PDE4D表達(dá)可能是電針抗抑郁作用的機(jī)制之一。

抑郁；電針；慢性應(yīng)激；磷酸二酯酶4；大鼠

［本文著錄格式］景泉凱，賽音朝克圖，姚海江，等.電針對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬磷酸二酯酶4及其亞型表達(dá)的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（9）:1011-1014.

CITED AS:Jing QK，Saiyin CKT，Yao HJ，et al.Effect of electroacupuncture on expression of phosphodiesterase 4 and subtypes in hippocampus in ratswith chronic stressdepression［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（9）:1011-1014.

抑郁癥是一種以持續(xù)心境低落為主要特征的綜合征。作為一種嚴(yán)重危害人類健康的情感障礙性精神疾病，抑郁癥具有高發(fā)病率、高致殘率和高自殺率的特點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測，到2020年抑郁癥將成為全球僅次于心臟病的第二大疾患［1-2］。抑郁癥是一個涉及多機(jī)制的復(fù)雜病癥，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［3-5］。磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）近年來一直被認(rèn)為是一個潛在的抗抑郁靶點(diǎn)而被大量研究［6-7］。PDE4抑制劑在抑郁模型動物的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的抗抑郁效果［8-9］。

針刺療法對抑郁癥有較好的臨床療效，與抗抑郁藥相比，針刺具有起效快、毒副作用小、費(fèi)用低廉等優(yōu)勢。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，針刺是通過多層次、多靶點(diǎn)、多通路綜合調(diào)節(jié)抑郁癥癥狀［10-11］。本研究探討電針抗抑郁作用與PDE4的關(guān)系，以期能為臨床電針抗抑郁作用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組

成年Sprague-Daw ley大鼠40只，雄性，體質(zhì)量（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。溫度（25±2）℃，濕度（50±20）%，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物房。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食，自然晝夜節(jié)律光照。1周后采用開野試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)及體質(zhì)量測量進(jìn)行行為學(xué)評分，剔除開野試驗(yàn)過于活躍和安靜的大鼠，余下32只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、電針組、氟西汀組，每組8只。

1.2藥品與試劑

TRNzol試劑：天根生化科技（北京）有限公司。DNAMarker：TAKARA公司。鹽酸氟西汀膠囊：禮來蘇州制藥有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

QL-902渦旋振蕩儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。Centrifuge 5415D離心機(jī)：EPPENDORF公司。NANODROP 2000分光光度計(jì)：THERMO SCIENTIFIC公司。ABI7500熒光定量PCR儀：APPLIED BIOSYSTEMS公司。

LH202韓氏穴位神經(jīng)刺激儀：北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所監(jiān)制，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司。華佗牌無菌針灸針，直徑0.3mm，長13mm：天津杏林書院醫(yī)療器械有限公司。

1.4造模方法

除空白組外，其余大鼠采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictablemild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的方法［12-13］造模。刺激方式包括以下7種：①4℃冷水中游泳5min；②禁食24 h；③禁水24 h；④晝夜顛倒24 h；⑤夾尾（距離尾尖2 cm，3min）；⑥潮濕環(huán)境24 h；⑦束縛3 h。隨機(jī)刺激21 d，保證每種刺激平均應(yīng)用3次。

除空白組群養(yǎng)外，其余均單只飼養(yǎng)，分別飼養(yǎng)于不同房間。

1.5干預(yù)方法

空白組正常條件飼養(yǎng)21 d，不予任何刺激。模型組每天施以與電針組相同時間、同等強(qiáng)度的捆綁，并進(jìn)行慢性應(yīng)激造模處理21 d。電針組行慢性應(yīng)激造模處理21 d，并于每天應(yīng)激造模前1 h行電針治療：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［14］，取百會、印堂，平刺，百會穴針尖向后頭部，印堂穴針尖向鼻尖方向，進(jìn)針0.5～1 cm；電針頻率2 Hz，電流強(qiáng)度以大鼠頭部微顫為宜，每次留針20min，每天1次。氟西汀組接受進(jìn)行慢性應(yīng)激造模處理21 d，每天造模前1 h將氟西汀用生理鹽水配成1mg/m l溶液，2mg/kg灌胃給藥，每天1次。

1.6開野試驗(yàn)

［15］方法，在自制敞箱（80×80×40 cm）中進(jìn)行。內(nèi)側(cè)周壁及底部均為黑色，底部用白線劃分為面積相等的25塊方格。將大鼠置于中心方格內(nèi)，人距離大鼠1m以上，觀察大鼠5min內(nèi)穿越格數(shù)，記為水平運(yùn)動次數(shù)；后肢直立次數(shù)記為垂直運(yùn)動次數(shù)。每只動物檢測完畢，清理干凈敞箱后再進(jìn)行下一只動物的檢測。分別于造模前和實(shí)驗(yàn)第22天進(jìn)行。

1.7取材

造模后22 d，大鼠10%水合氯醛380mg/kg腹腔注射麻醉，迅速斷頭，按照大鼠神經(jīng)解剖圖譜在超凈臺內(nèi)冰上剝離大腦，取海馬50mg放入1.5m l滅菌離心管中，-80℃保存。

1.8RT-PCR

根據(jù)文獻(xiàn)確定GAPDH、PDE4A及PDE4DmRNA的PCR引物序列，引物由北京INVITROGEN公司合成。

GAPDH：上游5'-CCT TCC GTG TTC CTA CCC C-3'；下游5'-GCCCAGGATGCCCTTTAG TG-3'

PDE4A：上游5'-CAG TGG ACC GAC CGC ATC A-3'；下游5'-TCCAGCGTG TCCAGGATG TC-3'

PDE4D：上游5'-CCG CTT TGG AGG CTG TTT TC-3'；下游5'-TAC ATC AAG GCA AGT TCC GAG TTT-3'

TRNzol總RNA提取試劑提取mRNA。紫外分光光度計(jì)定量mRNA純度較好。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用兩步法，采用PrimeScriptTMRT reagentKitwith gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系20μl。熱循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸40 s，共45個循環(huán)。PCR相對定量分析以在組織中表達(dá)穩(wěn)定的GAPDH條帶為內(nèi)參照，用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示。用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1開野試驗(yàn)

應(yīng)激前各組大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動無顯著性差異（P＞0.05）。應(yīng)激刺激后，與空白組比較，模型組水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動均顯著減少（P＜0.001）。與模型組比較，氟西汀組與電針組水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動均顯著升高（P＜0.001）。見表1。

表1　各組應(yīng)激前后開野試驗(yàn)比較

2.2RT-PCR

與空白組比較，模型組海馬PDE4A、PDE4D mRNA表達(dá)顯著增多（P＜0.001），電針組PDE4A、PDE4D mRNA表達(dá)較模型組顯著減少（P＜0.001），與空白組比較無顯著性差異（P＞0.05）。氟西汀組海馬PDE4A、PDE4D mRNA表達(dá)與空白組無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

3　討論

抑郁癥是一種涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)、腦區(qū)及環(huán)路的疾病，腦內(nèi)其他諸多生化物質(zhì)或/和系統(tǒng)也參與抑郁癥的病理學(xué)過程。目前針刺治療抑郁癥的機(jī)制研究多從神經(jīng)遞質(zhì)及其受體、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)信號通路、細(xì)胞因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元凋亡等方面入手［16］。

表2　各組海馬PDE4A、PDE4Dm RNA表達(dá)（2-△△CT）

近年來，PDE4抑制劑對于抑郁癥的研究已經(jīng)較為深入和成熟［17］。

PDE4是環(huán)磷酸腺苷（cAMP）特異性水解酶。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與機(jī)體多種新陳代謝活動，腺苷酸環(huán)化酶的合成和PDE的水解作用之間的平衡決定其胞內(nèi)的濃度水平。哺乳動物PDE是一個蛋白酶超家族，分為11個亞型［18］，其中PDE4能夠特異性水解胞內(nèi)cAMP，對控制胞內(nèi)cAMP水平有重要作用，被認(rèn)為是治療抑郁癥、認(rèn)知損傷等神經(jīng)精神疾病的重要潛在靶標(biāo)［19-20］。在哺乳動物中，PDE4有A、B、C、D 4個亞型，其中PDE4A和PDE4D是抗抑郁藥發(fā)揮治療活性作用的主要亞型［21］。

本研究采用的CUMS模型，與抑郁癥具有高度相似性，可引起一系列與抑郁癥患者相似的行為和神經(jīng)系統(tǒng)改變，是目前公認(rèn)的經(jīng)典模型之一［22］。本研究顯示，模型大鼠的探究行為和運(yùn)動能力降低，提示模型復(fù)制成功；電針治療后，大鼠抑郁行為改善。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起關(guān)鍵作用［23-24］。抑郁癥病位在腦，針灸治療重在健腦調(diào)神。電針督脈經(jīng)穴為主的頭部穴位在抑郁癥治療中較為常用［25］。本研究選用臨床使用頻率最高的百會和印堂。百會又名“巔上”、“五會”，是手足三陽與督脈、肝經(jīng)之會，針刺百會穴可以平肝潛陽，疏肝理氣。針刺印堂有活絡(luò)疏風(fēng)，鎮(zhèn)痙安神的作用。

本研究顯示，模型大鼠海馬PDE4A、PDE4D表達(dá)量增加，電針組較模型組減少，且與空白組無顯著性差異。提示抑郁癥與海馬內(nèi)PDE4A、PDE4D表達(dá)升高有關(guān)；抑制PDE4A、PDE4D表達(dá)可能是電針抗抑郁作用的機(jī)制之一。

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Effect of Electroacupuncture on Expression of Phosphodiesterase 4 and Subtypes in Hippocam pus in Ratswith Chronic StressDepression

JING Quan-kai1，SAIYIN Chao-ke-tu2，YAO Hai-jiang3，4，LüWei1，AOCUN You-dou1，YANG Li-juan1，LIU Jun-tong1，LIZhi-gang1
1.Departmentof Acupuncture and Massage，Beijing University of ChineseMedicine，Beijing 100029，China；2.InnerMongolia InternationalMongolian Hospital Traditional Therapy Technique，Hohhot，InnerMongolia 010065，China；3.TreatmentCenterof TraditionalChineseMedicine，Beijing Bo'aiHospital，China Rehabilitation Research Center，Beijing 100068，China；4.CapitalMedicalUniversity Schoolof Rehabilitation Medicine，Beijing 100068，China

LIZhi-gang，SAIYIN Chao-ke-tu.E-mail:lizhigang620@126.com（LIZhi-gang）；saiyin2012@ 126.com（SAIYINChao-ke-tu）

Objective To explore the biologicalmechanisms of electroacupuncture（EA）for depression.Methods Forty male adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into control group（n=8），model group（n=8），EA group（n=8）and fluoxetine group（n=8）.Depressivemodelswere established with lonely raising and chronic unpredictablemild stress.They were tested with Open-field Test，and the expression of phosphodiesterase 4（PDE4）A and PDE4D in hippocampuswas detected with RT-PCR.Results The cross and rear scores were significantly lower in themodelgroup than in the controlgroup（P＜0.001），while it increased in the EA group and the fluoxetine group（P＜0.001）.Compared with themodelgroup，the expression of PDE4A and PDE4D decreased in the EA group（P＜0.001）.Conclusion Electroacupuncturemay relieve depression through inhibiting the expression of PDE4A and PDE4D.

depression；electroacupuncture；chronic stress；phosphodiesterase 4；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.09.005

R749.4

A

1006-9771（2016）09-1011-04

2016-04-10

2016-05-17）

1.國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81360576）；2.國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.8172860）；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2015MS08130）。

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京市100029；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特市010065；3.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院康復(fù)科，北京市100068；4.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068。作者簡介：景泉凱（1990-），男，漢族，吉林長春市人，碩士研究生，主要研究方向：針刺干預(yù)中樞神經(jīng)損傷的機(jī)理研究。通訊作者：李志剛、賽音朝克圖。E-mail:lizhigang620@126.com（李志剛）；saiyin2012@126.com（賽音朝克圖）。